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1、纯化水细菌、霉菌及酵母菌计数验证方案纯化水细菌、霉菌及酵母菌计数验证方案1 概述：概述：本本法是用于建立微生物检查法时，根据中国药典 2005 年版二部分要求，需对细菌、霉菌及酵母菌的计数方法进行验证。故计划于 2006 年 9 月份对细菌、霉菌及酵母菌的计数方法进行验证。2 原理：原理：根据不同的样品，制备成供试液，再将规定量的供试液通过膜微过滤系统真空抽滤，将滤膜进行培养，对形成的菌落计数，或通过采用平皿法对形成的菌落计数，从而了解供试品的微生物含量。3 菌种：菌种：大肠埃希菌CMCC（B）44102金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003枯草芽孢杆菌 CMCC（B）65301白色念珠菌CM
2、CC（B）98001黑曲霉CMCC（B）980034 培养基：培养基：营养琼脂培养基 改良马丁琼脂培养基 5 试剂：试剂：pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液 6 设备：设备：MILLPORE 微膜过滤系统7 检测方法：检测方法：7.1 菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养琼脂培养基中培养 37培养 18-24 小时，用 0.9%无菌氯化钠溶液将培养物制备成菌悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度 10 倍稀释至10-5-10-7，约为 50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁
3、琼脂培养基中 25-28培养 18-24小时，用 0.9%无菌氯化钠溶液将培养物制备成菌悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度 10 倍稀释至 10-5-10-6，约为 50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。接种黑曲霉孢子液至改良马丁琼脂培养基中，经 25培养 5-7 天，加入 3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸取孢子悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度 10 倍稀释至 10-4，约为 50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。 7.2 活菌计数 分别取上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌 10-5-10-7稀释液
4、各 1ml 加入平皿，再用不超过 45的营养琼脂培养基 20ml 注皿，每个菌株各测定 2 皿，30-35培养 48 小时，计算菌落数。分别取上述白色念珠菌 10-5-10-6稀释液、黑曲霉 10-4稀释液各 1ml 加入平皿，再用不超过 45的琥珀红琼脂培养基 20ml 注皿，每个菌株各测定 2 皿，23-25培养逐日观察计数。7.3 供试液的制备取供试品 10ml 加入到 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 90ml 中，混匀后即为 1：10 供试液。取上述 1：10 供试液，加入到 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 90ml 中，混匀，作为 1：100 供试液。7.4 回收率的测定
5、薄膜过滤法：7.4.1.试验组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，后取1：100 供试液 100ml、50-100cfu 试验菌同时加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。7.4.2.菌液组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，后取灭菌 pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 100ml、50-100cfu 试验菌同时加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。7.4.3.供试品对照组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，
6、后取 1：100 供试液 100ml 加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。8 验验证证内内容容、方方法法及及限限度度：8.1 设备确认8.1.1 检查验证所使用的设备的检定状，并按下列方式记录检查结果。设备名称及型号产地检定结论备注MILLPORE 微膜过滤系统美国8.1.2 检查 纯化水的细菌、霉菌及酵母菌计数测定的方法 验证所需文 件。文件名称存放处微生物限度（细菌、霉菌、酵母菌含量）测定标准操作细则三联式 Microfil 过滤系统使用标准操作细则中华人民共和国药典 2005 年版二部8.2 回收率的计算按如下公式计算试验组的加菌回收率：试验组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数试验组的加菌回收率 100%菌液组的平均菌落数8.2 试验限度经过三次独立的平行试验该供试品接种 5 株阳性试验菌株，实施薄膜过滤法检查的加菌回收率均不低于 709 验验证证参参加加人人员员部 门姓 名职 称备 注10 批批准准本验证方案报质量保证部门复核并审核。
