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1、结合特罗凯（厄洛替尼）的焦点粘附激酶抑制剂在非小细结合特罗凯（厄洛替尼）的焦点粘附激酶抑制剂在非小细胞肺癌中表现出增强的抗肿瘤活性胞肺癌中表现出增强的抗肿瘤活性摘要摘要阻断表皮生长因子受体（EGFR）活性一直是非小细胞肺癌（NSCLC）的主要治疗靶点。由于具 有野生型 EGFR 的患者已经证明只有 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的适度受益，野生型 EGFR 患者需要额外的治疗方法。作为下游整合素信号传导和已知 EGFR 受体杂交的关键组 成部分，我们假设靶向粘着斑激酶（FAK）活性也已被证明与 NSCLC 的侵袭期相关，将导致 EGFR TKIs 的活性增强。因此，EGFR TKI 耐
2、药 NSCLC 细胞（A549，H1299，H1975）均用 EGFR TKI 特罗凯（厄洛替尼）和 FAK 抑制剂（PF-573,228 或 PF-562,271）作为单一药剂和组 合治疗。我们确定细胞活力，细胞凋亡和体外三维生长，并在体内评估肿瘤生长。单独使用 FAK 抑制剂治疗 EGFR TKI 抗性 NSCLC 细胞有效抑制所有测试细胞系的细胞活力; 然而， 当在体外在 2 维和 3 维测定中测试时，其与 EGFR TKI 特罗凯（厄洛替尼）联合使用在降低 细胞活力方面比单独治疗更有效，在 A549 细胞中获得增强的益处。这种增加的功效可能部 分是由于当药物联合使用时观察到的 Akt
3、磷酸化的抑制，其中再次用药物组合治疗后，A549 细胞表现出最大的抑制作用。结合特罗凯（厄洛替尼）与 FAK 抑制剂在体内也是有效的，通 过 A549 小鼠异种移植模型中肿瘤生长减少证实。我们进一步确定增强的敏感性与 LKB1 突 变状态无关。总之，我们证明了结合特罗凯（厄洛替尼）和 FAK 抑制剂用于已知 EGFR 野生 型 EGFR TKI 抗性细胞的有效性，潜在的细胞类型（包括 A549）可能对这种联合治疗特别敏 感。因此，对这种联合治疗的进一步评估是有必要的，并且可以证明是具有固有 EGFR TKI 抗性 NSCLC 的患者的有效治疗方法。我们进一步确定增强的敏感性与 LKB1 突变状
4、态无关。 总之，我们证明了结合特罗凯（厄洛替尼）和 FAK 抑制剂用于已知 EGFR 野生型 EGFR TKI 抗性细胞的有效性，潜在的细胞类型（包括 A549）可能对这种联合治疗特别敏感。因此，对这 种联合治疗的进一步评估是有必要的，并且可以证明是具有固有 EGFR TKI 抗性 NSCLC 的 患者的有效治疗方法。我们进一步确定增强的敏感性与 LKB1 突变状态无关。总之，我们证 明了结合特罗凯（厄洛替尼）和 FAK 抑制剂用于已知 EGFR 野生型 EGFR TKI 抗性细胞的有 效性，潜在的细胞类型（包括 A549）可能对这种联合治疗特别敏感。因此，对这种联合治疗的 进一步评估是有必要
5、的，并且可以证明是具有固有 EGFR TKI 抗性 NSCLC 的患者的有效治 疗方法。阻断表皮生长因子受体（EGFR）活性一直是非小细胞肺癌（NSCLC）的主要治疗靶点。 由于具有野生型 EGFR 的患者已经证明只有 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的适度受益， 野生型 EGFR 患者需要额外的治疗方法。作为下游整合素信号传导和已知 EGFR 受体杂交 的关键组成部分，我们假设靶向粘着斑激酶（FAK）活性也已被证明与 NSCLC 的侵袭期相关， 将导致 EGFR TKIs 的活性增强。因此，EGFR TKI 耐药 NSCLC 细胞（A549，H1299，H1975） 均用 EGFR T
6、KI 厄洛替尼和 FAK 抑制剂（PF-573,228 或 PF-562,271）作为单一药剂和组合治 疗。我们确定细胞活力，细胞凋亡和体外三维生长，并在体内评估肿瘤生长。单独使用 FAK 抑制剂治疗 EGFR TKI 抗性 NSCLC 细胞有效抑制所有测试细胞系的细胞活力; 然而，当在 体外在 2 维和 3 维测定中测试时，其与 EGFR TKI 厄洛替尼联合使用在降低细胞活力方面 比单独治疗更有效，在 A549 细胞中获得增强的益处。这种增加的功效可能部分是由于当药物联合使用时观察到的 Akt 磷酸化的抑制，其中再次用药物组合治疗后，A549 细胞表现出 最大的抑制作用。结合厄洛替尼与 F
7、AK 抑制剂在体内也是有效的，通过 A549 小鼠异种移植 模型中肿瘤生长减少证实。我们进一步确定增强的敏感性与 LKB1 突变状态无关。总之，我 们证明了结合厄洛替尼和 FAK 抑制剂用于已知 EGFR 野生型 EGFR TKI 抗性细胞的有效性， 潜在的细胞类型（包括 A549）可能对这种联合治疗特别敏感。因此，对这种联合治疗的进一 步评估是有必要的，并且可以证明是具有固有 EGFR TKI 抗性 NSCLC 的患者的有效治疗方 法。我们进一步确定增强的敏感性与 LKB1 突变状态无关。总之，我们证明了结合厄洛替尼 和 FAK 抑制剂用于已知 EGFR 野生型 EGFR TKI 抗性细胞的
8、有效性，潜在的细胞类型（包 括 A549）可能对这种联合治疗特别敏感。因此，对这种联合治疗的进一步评估是有必要的， 并且可以证明是具有固有 EGFR TKI 抗性 NSCLC 的患者的有效治疗方法。我们进一步确定， 增强的敏感性与 LKB1 突变状态无关。总之，我们证明了结合厄洛替尼和 FAK 抑制剂用于 已知 EGFR 野生型 EGFR TKI 抗性细胞的有效性，潜在的细胞类型（包括 A549）可能对这种 联合治疗特别敏感。因此，对这种联合治疗的进一步评估是有必要的，并且可以证明是具有 固有 EGFR TKI 抗性 NSCLC 的患者的有效治疗方法。介绍 肺癌比全球任何其他类型的癌症多出死亡
9、 1 ，其中约 80的肺癌被归类为非小细胞肺癌 （NSCLC） 2 。表皮生长因子受体（EGFR）蛋白质是过表达的在高达非小细胞肺癌的 80， 因此 EGFR 一直是主要治疗靶 NSCLC 3，4 。为此，药物被设计为靶向 EGFR 的细胞外结 构域和细胞内激酶结构域。抑制剂靶向 EGFR 的激酶结构域，如特罗凯（厄洛替尼）吉非替尼 和在患者的活化突变已经显示承诺（即外显子 18，19 或 21）在 EGFR 5 - 8 ，虽然这些抑制 剂对患者窝藏野生型 EGFR 证明只有少量好处 9，10 。此外，EGFR 或 c-MET 扩增的二次 突变可以发展，赋予以前敏感的患者的抗性 11 。作为
10、EGFR 活化突变的发生率在大多数北 美和欧洲的人口相对较低的 12 - 15 ，有必要加强对 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（TKI）患者EGFR 野生型的敏感性。 焦点粘附激酶（FAK）是一种非受体酪氨酸激酶，其在细胞粘附于细胞外基质（ECM）的位点 处定位并介导 ECM 整合素接合下游的信号传导事件。已知 FAK 调节细胞存活，增殖和迁移 16 。FAK 表达也被证实在许多癌症类型包括肺癌 17 中被上调，从而将 FAK 定位为癌症 治疗中调节的重要靶标。为此，FAK 抑制剂已经被开发出来，其中包括 FAK 酪氨酸激酶活 性的药理学抑制剂 18，19 。FAK 的抑制作用已被证明影响许多包括
11、血管生成和转移细胞 过程为肿瘤的生长和疾病进展重要的 20 - 22 。此外，FAK 抑制剂已被证明能有效抑制肿瘤 生长在许多皮下异种移植物模型的 23，24 表示承诺作为单一药剂以及与其他抑制剂组合24 - 26 。 在 NSCLC 中，与正常肺组织相比，在肿瘤组织中观察到 FAK 的表达水平升高，并且这种增 加的表达与较高的疾病阶段相关 27 。这些发现表明 FAK 在 NSCLC 发展中的重要作用。 最近的证据也涉及 1 整合素在 EGFR TKI 吉非替尼耐药中的表达，NSCLC 细胞 1 整合素 消耗后，吉非替尼敏感性增加 28 。鉴于 FAK 是 1 整合素下游激活的主要激酶之一，
12、表明 ECM-粘附复合物信号传导对 EGFR TKI 治疗抗性的重要性。作为治疗 EGFR TKIs 的 NSCLC 患者的常规实践，越来越多的证据表明 FAK 在肺癌生长和进展中起主要作用，我们 着手测试将 EGFR 抑制剂特罗凯（厄洛替尼）与 FAK 抑制组合在 NSCLC 中的效用。我们调 查了两种 FAK 抑制剂 PF-573,228（PF-228）和 PF-562,271（PF-271）对小鼠异种移植模型中培 养和肿瘤生长中的 NSCLC 细胞生长的影响，作为单一试剂并与特罗凯（厄洛替尼）组合。我 们的研究结果表明，结合 FAK 抑制特罗凯（厄洛替尼）更有效地降低 EGFR 野生型
13、NSCLC 细胞活力的体外和异种移植物肿瘤生长的体内比单独的任一药物治疗，在 A549 细胞类型特定功效。从而，方法 细胞培养和试剂 人类细胞系 A549（EGFR 野生型）和 H1299（EGFR 野生型）购自 ATCC，而 H1975（EGFR L858R 和 T790M 突变），HCC827（EGFRE746-E750）和 HCC4006（EGFRL747-E749）细胞 系是明陶博士（加拿大多伦多玛格丽特医院）的礼物。将 A549 细胞维持在补充有 10胎牛 血清（FBS; Medicorp，Montreal，QC）的 DMEM（Mediatech，Manassas，VA）中，同时将
14、H1299，H1975，HCC827 和 HCC4006 细胞保持在 RPMI-1640（HyClone Laboratories，Logan ，UT）与 10FBS。所有细胞系在 37和 5CO 2 下生长。FAK 抑制剂 PF-573,228（PF-228） 购自 Tocris Bioscience（Bristol，UK）并溶解于 DMSO 中。埃罗替尼和 FAK 抑制剂 PF- 562,271（PF-271）购自上海生物化工有限公司（上海， 产生特罗凯（厄洛替尼）耐药细胞 最初对特罗凯（厄洛替尼）敏感的 HCC4006 细胞通过 5 轮剂量递增，从 0.005M 特罗凯（厄 洛替尼）开始
15、耐受埃洛替尼，并将浓度增加 5 倍，直到分离出耐药 3M 埃罗替尼的细胞。将 亲代细胞用等量的 DMSO 处理至在剂量递增实验持续时间内进行抗性选择的细胞，并将它 们用作所有后续实验的对照。 质粒转染 LKB1 到 A549 细胞 使用 GeneJuice 转染试剂（Novagen，Etobicoke，ON），用 pcDNA3-FLAG-LKB1（质粒 8590 29 ，Addgene，Cambridge MA）转染 A549 细胞以过表达 LKB1 或用 pcDNA3.1 作为载体对 照。将转染的细胞接种到多个组织培养皿中，48 小时后，用 500g/ ml 遗传霉素 （Invitrogen
16、，Burlington，ON）处理活性分裂的细胞，以促进选择表达质粒的细胞。汇集选择 后残留的每个组织培养皿中的细胞以产生表达 LKB1 和未表达 A549 细胞的多个合并克隆。 通过蛋白质印迹证实 LKB1 在 FLAG-LKB1 转染细胞中 LKB1 表达的确认和对照细胞中 LKB1 表达的持续缺乏。 siRNA 转染 或者用 Oligofectamine 试剂（Invitrogen，Burlington，ON）用 siGENOME 非靶向对照siRNA2 或 siGENOME SMARTpool LKB1 siRNA（catM-005035- 02，Dharmacon，Lafayette，CO）转染 H1299 细胞， 。通过 Western 印迹证实 LKB1 敲低的效 率。对于使用 siRNA 转染细胞的 MTT 测定，药物治疗在转染后 48 小时开始。对于涉及用 EGF 刺激细胞进行 Western 印迹的实验，siRNA 转染的细胞在生长因子刺激之前转染后 48
