链霉菌的分子育种策略

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1、链霉菌的分子育种策略链霉菌的分子育种策略摘要：现在链霉菌的选育已经进入分子育种阶段。其过程包括利用基因阻 断、敲除、替换等突变技术了解基因的功能、表达、调控，进而进行抗生素的 修饰、改造；将整个次生代谢产物合成基因簇转移到易于工业化操作的宿主系 统中，引入抗性基因、调节基因和引入血红蛋白基因；利用基因筛选程序，筛 选含有特定类型化合物的基因产生菌，进而获得了相应的次生代谢产物；利用 基因组重排技术对出发菌株进行处理等。链霉菌接合转移体系研究的提出为分 子育种打开了一个新的方向。系统改变基因结构可产生一个完整的突变株文库， 从而构建大规模生产不同抗生素的工程菌。关键词：链霉菌，分子育种，基因Me

2、thod of Streptomycess molecular breedingAbstract:Now The breeding of Streptomyces hashas enteredentered thethe stagestage ofof molecularmolecular breedingbreeding. . TheThe processprocess includesincludes: : UsingUsing genegene disruption,disruption, knockout,knockout, replacementreplacement mutatio

3、nmutation technologytechnology toto understandunderstand genegene function,function, expression,expression, regulationregulation andand controlcontrol andand t thenhen havehave the,the, modificationmodification ofof antibiotics.antibiotics. TheThe secondarysecondary metabolitemetabolite biosynthesis

4、biosynthesis genegene clustercluster isis transferredtransferred toto thethe easyeasy industrialindustrial operationoperation ofof thethe hosthost system,system, introducingintroducing thethe resistanceresistance genegene, , genegene regulationregulation andand introducingintroducing thethe hemoglob

5、inhemoglobin gene;gene;UseUse ofof geneticgenetic screeningscreening programs,programs, screeningscreening ofof specificspecific typestypes ofof compoundscompounds containingcontaining thethe genegene producingproducing strain,strain, andand obtainedobtained thethe correspondingcorresponding seconda

6、rysecondary metabolites;Usemetabolites;Use ofof genomegenome shufflingshuffling onon thethe startingstarting strainstrain processingprocessing andand soso onon . . thethe conjugativeconjugative transfertransfer systemsystem researchresearch ofof StreptomycesStreptomyces hashas openedopened a a newne

7、w directiondirection forfor 1molecularmolecular breedingbreeding SystemSystem changeschanges inin genegene structurestructure cancan produceproduce a a completecomplete mutantmutant librarylibrary, , soso asas toto constructconstruct thethe massmass productionproduction ofof differentdifferent antib

8、ioticantibiotic engineeringengineering bacteria.bacteria.Key words: Streptomyces；molecular breeding,；DNA链霉菌是一类细胞壁类型为 I 型、革兰氏阳性、好气的最高等的放线菌。 它是一种重要的资源微生物，具有广泛的物种多样性和代谢多样性，已知放线 菌所产抗生素的 90由本属产生。 1但随着抗生素的高剂量大面积使用，抗 生素的使用寿命也随之缩短，从而使得快速选育高产量、产新抗生素的链霉菌 显得尤其重要。随着基因工程技术和分子生物学手段的不断发展以及对微生物 次生代谢机制的进一步了解，链霉菌的选育已

9、由原来随机诱变筛选进入到分子 育种阶段。分子育种，就是将基因工程应用于育种工作中，通过基因导入，从而培育 出一定要求的新品种的育种方法。许多科研工作者将基因工程技术运用到了链 霉菌育种之中，这包括：利用基因阻断、敲除、替换等突变技术了解基因的功 能、表达、调控，进而进行抗生素的修饰、改造；将整个次生代谢产物合成基 因簇转移到易于工业化操作的宿主系统中，引入抗性基因、调节基因和引入血 红蛋白基因；采用各种基因操作技术，使不同化合物、不同来源的基因在同一 菌株中重新组合，增加代谢产物的多样性2；利用基因筛选程序，筛选含有特 定类型化合物的基因产生菌，进而获得了相应的次生代谢产物3；利用基因组 重排

10、技术对出发菌株进行处理4，1 1 扩增表达次生代谢过程限速酶的基因扩增表达次生代谢过程限速酶的基因抗生素在链霉菌体内的生物合成是由一系列酶催化产生的，在整个合成过 程所用酶系中，限速酶的浓度大小是影响抗生素产量的重要因素5。深入了解 限速酶基因，通过扩增该酶基因的拷贝数，可提高目的抗生素产量。1993年， Malmberg 等6对带小棒链霉菌（S.clavuligerus）生物合成头霉素和头孢霉 素的过程进行研究， 结果发现-氨基乙二酸前体的产生是生物合成的限速步 骤之一。他们从带小棒链霉菌中克隆了赖氨酸氨基转移酶LAT 编码基因，并使 之在宿主染色体上多拷贝表达，增加了LAT 酶数量，提高了

11、头孢霉素的产量。2 2 敲除负调控基因敲除负调控基因敲除负调控基因，抑制无关代谢活动可增加细胞对目标产物合成在能量和 碳源上的供应，从而提高目的抗生素的产量。2001 年，Paradkar 等7对带小 棒链霉菌次生代谢产物进行研究发现，带小棒链霉菌同时合成2种结构上无关的 次生代谢产物头孢霉素C 和克拉维酸，虽然这2 种次生代谢产物的生物合成具 有完全独立的途径，但它们通过相互竞争初生代谢的能量和碳源来进行次生代 谢的合成活动。通过敲除头孢霉素C 合成所必需的基因lat，可以完全停止头孢 霉素C 的合成，而在lat 突变株中克拉维酸的产量提高了2-2.5倍。23 3 将整个次生代谢产物合成基因

12、簇转移至易于工业化操作的宿主系将整个次生代谢产物合成基因簇转移至易于工业化操作的宿主系统统天蓝色链霉菌是最早应用于次生代谢产物异源合成的宿主系统的模式菌。 1993年，McDaniel等8通过基因敲除放线紫红素合成基因构建了工程表达宿主 天蓝菌CH999，还成功构建了在该菌株中表达大片段的低拷贝穿梭质粒 pRM5。pRM5携带了编码actact启动子激活蛋白的actact双向启动子 序列act-ORF4 基因。4 4 改造抗性基因提高抗生素产量改造抗性基因提高抗生素产量一般来说，结构基因结构比较保守，难以进行有效改造。抗性基因是激 活结构基因转录的必需成分，在对抗生素产生抗性的过程中具有较大的

13、进化空 间。在长期的进化中，链霉菌必须积累适当的抗生素耐药基因和相应的调节基 因，以保护自身免受这些致命的代谢物的破坏9。因此，改造抗性基因及其调 控基因或提高这些基因的表达水平可以增强菌体对自身产生的抗生素的抗性， 从而提高该抗生素的产量。早在五十年代初，人们就发现抗生素的抗性水平与抗生素产量之间有一 定的联系，并把提高抗性水平作为获得抗生素高产菌株的途径之一10。以后 多年也不断有相关报导11。提高野生链霉菌菌株中的抗性基因拷贝数，不仅 能够提高菌株的耐药水平，还能提高单位菌体的抗生素产量121984 年， Thompson。和 Davies 提出抗生素生产限速因素之一是菌株对该抗生素的耐

14、受力。 两年后， Crameri 和 Davies 据此通过扩增抗性基因提高了氨基糖普类抗生素产量 13。他们将卡那霉素链霉菌(S. myceticus ) M 1164 的 6一乙酞转移酶(抗 性基因产物，氨基糖普修饰酶)基因克隆到高拷贝质粒载体 pIJ702，转导到卡 那霉素链霉菌 ATCC 12853(卡那霉素产生菌)和弗氏链霉菌(S.fradiae ) ATCC10745(新霉素产生菌)中。结果表明包含有重组质粒的转化子均提高了对氨 基糖普类抗生素的耐受性，并大大提高了卡那霉素和新霉素的产量。 近年来，已有一些利用抗性基因的人工进化方式产生有益突变提高抗生素 产量的成功例子，如引入链霉

15、素抗性基因的突变可提高抗生素产量高达 48 倍 14黄健强等15筛选获得含有丝裂霉素 C 抗性基因的 612kb 外源片段的克隆 子。将含此外源片段的质粒 pLX5 导入变铅青链霉菌(S. lividans)获得表达。 并且首次成功地运用电穿孔法将 pLX5 导入野生型菌株中，使其对丝裂霉素 C 的 抗性大幅度提高:最低抑制浓度(MIC)由原来的 200 pg/ ml 上升至 1000 pg/ ml 以上。涂国全等16通过采用链霉菌致死标记，获得了大量链霉素抗性基因 (str)突变株，并进一步筛选到梅岭霉素高产菌株，梅岭霉素活性单位提高了 77.9%。通过不同剂量 EMS 诱变分析抗药性突变率

16、和:tr 突变株产梅岭霉素产量， 结果表明菌株抗药性突变与产量突变密切相关。5 5 引入血红蛋白基因引入血红蛋白基因链霉菌发酵过程中若能在链霉菌中导入血红蛋白基因，表达血红蛋白，就 可使该细胞在贫氧状态下也能很好地生长。Maynolo 等将血红蛋白基因Vgb通过 质粒pIJ699 转入变青链霉菌(S.lividans)和天蓝色链霉菌中获得了发酵需氧量3明显降低的工程菌17。该工程菌的在限氧条件下，不仅菌体生长量增加，而 且放线紫红素产量提高了10 倍。6 6 基因组改组基因组改组基因组改组技术主要是指将传统育种得到的具有不同表型的菌株进行全基 因重组,从而使得这些菌株的优良性状能集于一身。Zhang 等18在弗氏链霉菌