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1、大肠杆菌的培养1. LB 培养基配制： （液体培养基） 取 1L 的烧杯，加入适量的一蒸水（1000ml） ，称取胰蛋白胨 10g , 酵母提取物 5g , Nacl 10 g 倒入烧杯中 加入磁子搅拌，至完全溶解 用 NaoH 调 PH=7.0，定容至 1L 分装后高压蒸汽灭菌 （固体培养基） 在液体培养基的基础上加入琼脂糖：1L 液体培养基15g 琼脂糖（用水先溶解） 在电炉子上边加热边搅拌至煮沸溶解 分装后高压灭菌 抗生素的加入温度要求：高压灭菌后，将融化的 LB 固体培养基置与 55的水浴中，待培 养基温度降到 55时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇 匀。
2、注意事项： 电炉子温度不要太高，烧杯直接加热时电炉子上要加石棉网 高压灭菌时，瓶盖上要插上针头，防止灭菌时瓶盖喷出 2. 倒平板： 培养皿要提前进行灭菌、烘干，在超净工作台里，打开酒精灯，在酒精灯的火焰旁进行操 作，倒完后做好标记 3. 接种（平板划线分离法）： 接种环挑取大肠杆菌进行接种：图式：注意：每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。 4. 37恒温培养箱培养： 接种好的培养皿正置 15 分钟，然后倒置放入培养箱过夜培养 倒置培养原因：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸汽的形式蒸发，倒置培养皿则会使 水蒸汽凝结成水滴留在盖上。如果正方，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。 如果培养
3、皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。大肠杆菌感受态的制备及转化感受态感受态：细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态。 转化转化：是指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 一、制备：步骤从大肠杆菌 DH5 的培养平板上挑取一个单菌落接于 2mL LB 液体培养基的试管中，37振荡培养过夜。 以 1%的接种量将以上过夜培养物接种于液体培养基中 37振荡培养 23h 将菌液转移到 50mL 离心管中，冰上放置 10min 4000rpm，离心 10min 回收细胞 倒出培养液，将管倒置 1min 以便培养液流尽 用冰冷的 0.1mol/L C
4、aCl 2 10mL，悬浮沉淀 立即放在冰上保温 30min 4，4000rpm，离心 10min，回收细胞 用冰冷的 0.1mol/L CaCl 2 2mL 悬浮细胞（务必放冰上） 分装细胞，每 200l 一份。此细胞为感受态细胞。二、转化：步骤： 在 200l 新鲜配制的感受态细胞中加入质粒 DNA2l(50ng)， 混匀同时做以下对照管 （受体菌对照：200l 感受态细菌+2l 无菌水 质粒对照：200l 0.1mol/L CaCl 2 溶液+2l 质粒） 冰上放置 30min 将管放到 42循环水浴热冲击 90s 取出，迅速冰浴 2min 每管加 800l LB 液体培养基，37慢摇复
5、苏 1h 取 50l 已转化的感受态细胞或对照样品， 各分别涂在含有或不含有氨苄青霉素的培养皿中 待吸干菌液后，倒置培养皿，于 37培养过夜 次日在含氨苄青霉素的培养皿上长的菌落即为含有质粒的大肠杆菌（即转化成功）质粒 DNA 的提取1.溶液： 溶液：50 mmol/L 葡萄糖 、25 mmol/L Tris （pH=8.0） 、10 mmol/L EDTA 溶液：0.4mol/L NaoH、2% SDS 溶液：5mol/L 醋酸钾（KAc）：60ml、冰醋酸：11.5 ml、H2O： 28.5 ml 2.步骤： 在锥形瓶中加入 100mL 液体培养基，向培养基中加入 100ul 氨苄青霉素
6、挑取单菌落接种于锥形瓶中，37培养过夜 次日，取 1.5ml 培养物于 EP 管中，4000rpm 离心 2min 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥 将细菌沉淀悬浮于 100ul 溶液中，充分混匀，室温放置 10min 加 200ul 溶液（新鲜配制） ，盖紧管皿，轻柔混匀混合物，冰上放置 5min 加入 150ul 预冷的溶液，盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置 15min 12000rpm 离心 15min，将上清转移至另一 EP 管 向上清中加入等体积的氯仿（去蛋白） ，反复混匀， 12000rpm 离心 5min，将上清转移至另一 EP 管 向上清中加入 2 倍体积的无水乙醇，混匀后，
7、室温放置 510min， 12000rpm 离心 5min，倒去上清液，把 EP 管倒扣在吸水纸上，吸干液体 用 1ml70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀，震荡并离心， 倒去上清液，真空抽干或空气中干燥 加入 20ul TE 缓冲液或无菌水，溶解 DNA，-20保存 3.注意事项： 在混匀时，不能剧烈震荡，动作一定要轻柔。 氯仿抽提完，转移上清时，一定不要吸到中间蛋白层，宁少勿多。质粒 DNA 的鉴定琼脂糖凝胶电泳检测 DNA步骤： 1.制备琼脂糖凝胶电泳：在锥形瓶中加入 45 ml 0.5TBE 缓冲液，称取 0.45g 琼脂糖放入 锥形瓶中，置微波炉中 2min，中火加热至完全熔化，取出摇匀
8、，则为 1%的琼脂糖凝胶。 2.待琼脂糖凝胶冷却至 70时，加入 10ul 溴化乙锭（Eb） 3.取有机玻璃内槽，洗净晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好，一定要封严， 放好梳子 4.将冷到 60琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的 胶面（注意不要形成气泡） 5.目视凝胶凝固后，再过半个小时，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内，加入 0.5TBE 缓冲液至电泳槽中，加至液面刚没过胶板约 1mm 6.加样：将 buffer（染料）与被测 DNA 混合，用移液枪将样品加入到梳子孔中，对照滴在 最下面的孔 7.电泳：接通电源，调节电压 120V、电流 80mA 8
9、.观察结果：在将胶板放在紫外灯下，连接电脑，拍照。氨苄青霉素氨苄青霉素（ampicillin） （100mg/ml） 溶解 1g 氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至 10ml。分装成小份于-20贮存。常以 25ug/ml50ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素羧苄青霉素（carbenicillin） （50mg/ml） 溶解 0.5g 羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至 10ml。分装成小份于-20贮存。 常以 25ug/ml50ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林甲氧西林（methicillin） （100mg/ml） 溶解 1g 甲氧西林钠于足量的水中，
10、最后定容至 10ml。分装成小份于-20贮存。常以 37.5ug/ml 终浓度与 100ug/ml 氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素卡那霉素（kanamycin） （10mg/ml） 溶解 100mg 卡那霉素于足量的水中，最后定容至 10ml。分装成小份于-20贮存。常以 10ug/ml50ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。 氯霉素氯霉素（chloramphenicol） （25mg/ml） 溶解 250mg 氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至 10ml。分装成小份于-20贮存。常以 12.5ug/ml25ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。 链霉素链霉素（streptomy
11、cin） （50mg/ml） 溶解 0.5g 链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至 10ml。分装成小份于-20贮存。 常以 10ug/ml50ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸萘啶酮酸（nalidixic acid） （5mg/ml） 溶解 50mg 萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至 10ml。分装成小份于-20贮存。常以 15ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。 四环素四环素（tetracyyline） （10mg/ml） 溶解 100mg 四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至 10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20贮存。常以 10ug/ml50ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。
