细胞支原体污染一般情况及预防措施

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1、细胞支原体污染一般情况及预防措施细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时,会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时,较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时,细胞之外观较无明显变化,但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。各国细胞库支原体污染的统计表,如下:国家 受支原体污染(%) 报告年度USAFDA 15 1993(past 30 years)USAATCC 15-20 1992Japan(IFO,RIKEN,JCR 803022 1981 1987-19931998GermanyDSM 36 1990-1994Argen

2、tina 65 1987Israel 32 1986-1993China 95 1990造成支原体高污染率的原因为:造成支原体高污染率的原因为: 1、支原体 size 0.10.8 um,无细胞壁,可透过一般过滤膜(0.22-0.45 um) 2、支原体污染时,没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 4、细胞流通间缺乏品管,造成实验室间的相互污染 5、研究或操作人员忽略污染问题支原体污染了来源:支原体污染了来源:1、已受污染的细胞 2、操作人员的疏失 3、已受污染的培养基、血清 4、操作环境不良、实验器具不洁等由于支原体为人体口腔中之正常菌丛,

3、实验室之操作人员的污染亦可能为污染源,须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时,最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃,以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染,有以下几种方法,只不过结果会与原始的细胞特性有差异。去除支原体污染:去除支原体污染: 1、抗生素处理:BM-cyclin(Roche),MRA(mycoplasma removal agent,ICN),Ciprofloxcin(Bayer),Enrofloxacin(Bayer) 2、Nucleic acid metabolites:5-bromouracil,Hoechst 33258,bromodeoxyuridin

4、e 3、Anti-sera 预防与控制方面可从以下各点加强注意:预防与控制方面可从以下各点加强注意:设备方面: 1、使用已作支原体测试 ok 之细胞株 2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞 3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞 检测方面:定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O 有否被支原体污染。实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求有关支原体污染之问题与回答:有关支原体污染之问题与回答:1、应如何避免细胞污染?细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操

5、作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。2、如果细胞发生微生物污染时, 应如何处理?直接灭菌后丢弃之。3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?不能。 除极有经验之专家外, 大多数遭受支原体污染的细胞株, 无法以其外观分辨之。4、支原体污染会对细胞培养有何影响?支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为 mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。5、侦测出细胞株有支原体污染时, 该如何处理?直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。 支原体之检测:支原体之检测: 直接培

6、养法 原理:直接培养支原体于培养基中,观察其生长及菌落生成。特点:是目前最直接与灵敏之步骤,亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。缺点:培养时间长,须 35 星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如 M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组,可能会造成污染。 材枓:dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿60

7、x15mm、L-玻棒、37培养箱、厌氧缸(厌氧缸长期培养易有污染,所以厌氧包应用无菌水,每次打开厌氧缸后,用 70% ethanol 擦拭内壁。) 培养基制备:基本配方为 Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长,可加入 penicillin(50u/ml)至 10x stock solution 或加入 thallium acetate (1:2000)至培养基中以防止其它细菌污染。 10x stock solution (1 lite

8、r) :称取 50 g dextrose,10 g L-arginine HCl,溶于 1 liter 蒸馏水中。以0.22m 无菌过滤膜过滤灭菌。分装 100 ml 至瓶中,保存于 -70。 液体培养基 (1 liter) :称取 21 g 之 Difco PPLO broth,0.02 g phenol red 于 600ml 蒸馏水中,加热搅拌溶解之。灭菌 121,15 分钟。待温度降低至室温后,于无菌操作台内加入 200ml 马血清,100ml 之 15% yeast extract solution,及 100ml 解涷之 10x stock solution,混合均匀后,分装至已灭

9、菌之有盖螺旋试管中,10ml/管。保存于 4,期限 1 个月。 固体培养基 (1 liter ):称取 21 g 之 Difco PPLO broth,0.02 g phenol red,15g Bacto agar 于 600ml 蒸馏水中,加热溶解之。灭菌 121,15 分钟。放在 50水中浴中,待温度降低至 50时,于无菌操作台内加入 200ml 马血清,100ml 之 15% yeast extract solution 及 100ml 解冻之 10x stock solution,混合均匀后,倒入 60x50之无菌培养皿中,5ml/培养皿。保存于 4,期限 1 个月。 步骤: 取 1

10、 ml 细胞培养液或 0.2ml 细胞悬浮液,接种于液体培养基中,置于 37培养二周,观察是否有混浊或是 pH 值改变之情形。培养一周及二周后,分别取 0.1 ml 液体培养液涂在 agar plate 上,将其倒放置于 37厌氧箱培养,培养至少 3 星期,持续观察是否有支原体之菌落出现。 另取 1 ml 细胞培养液或 0.2ml 细胞悬浮液,涂抹在 agar plate 上,37厌氧培养 3 星期,持续观察是否支原体菌落出现。 另作正负反应对照组,正反应对照组为 Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与 M. arginini (ATCC 23838)。负反

11、应对照组为待测细胞之新鲜培养基。结果判读: 支原体生长较慢,所以先在液体培养基培养 12 周增殖后,再培养于 agar plate 上。需至少培养 3 星期后,才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需 5 个星期才知正确结果。 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like),乃是由于支原体往 agar 下层生长所致,为圆形无色透明菌落,大小约 10-55m。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落,有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态(slime)。 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落,可将其自 agar plate 上切下,重新培养于液体培养基中,培养一星期后再种入 agar plate,若是细胞则不会生长。

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