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1、细胞的总蛋白质提取全过程及经验细胞的总蛋白质提取全过程及经验 如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项： 师兄给你的细胞要赶紧 裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般 我使用的时候， 是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧 4 度下离心，用预冷 的 PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一 般都是做 western 什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要 有活性的蛋白的。 一般 1000rpm 足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后 会损失蛋白。PBS 洗涤的最后 一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由 于普通的 10
2、mL 离心管有可能承受不了超声的 能量吧，我们师兄师姐一般都 用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。3s 每次， 间歇 3s 60 次， 400W，重复工作复位 2 次，总共超声 180 次就差不多了。 裂解后的细胞要赶 紧在 2500g 下离心 30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上 面加一层 封口膜离心。在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸 =50:50:0.1， 体积比。一般我加的是裂解液体积的 5 倍。沉淀液要预冷，我喜 欢将沉淀液放在-20 度下。 细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比 较多的白色沉淀出现，-20 度沉淀2h， 然后就可以高速沉
3、淀下蛋白了。这里 我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用 beckman 专用的那种 50mL 离心管，25000g，15-30min。 Beckman 离心管比较大，底部是平的，所以蛋 白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的 时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！ 然后用 5mL 做有的丙酮洗涤一遍，再用 75%酒精将 蛋白转移到 4mL 的离心 管中，当然，如果你的蛋白很少，1.5mL 的 EP tube 也可以使用。之 所以用 4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度， 一般 要求在 5-6mg/mL 之间，所以 buffer 的体积也会比较的大。 这里
4、蛋白在 离心的时候，是片状的，一定要慢慢转移，防止损失，不行就多次转移，每 次 都将离心管离心去上清。 转移后的蛋白离心除去酒精，这时候还是会有部分水 分的，就在冻干机里面冻干，尽量 在室温下操作。冻干后的蛋白质就可以保存 起来了。 然后在使用之前，测定蛋白质的浓度，如果你用了 8M 尿素溶解， 在酶解的时候，就需 要稀释到2M，所以蛋白初始浓度不能太低。在蛋白复溶 的时候，尽量在 4 度操作，然后一 定要慢慢的加 buffer，加多了就不好了，只 要蛋白能完全溶解就好。完全溶解的蛋白，会有 些粘稠，但是绝对不会有不溶 物产生，如果产生了不溶物，就说明需要加 buffer，一般复溶 这一步要进行一 个下午最少！
