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1、第 29卷 第 4期2010年 8月大 豆 科 学9 4 2010 v y ; v H q / V ,赵 琳,李永光,李文滨(东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)l : 2010203218 :大豆生物学教育部重点实验室开放基金资助项目(国家自然科学基金资助项目(30971810);大豆光周期基因的克隆和功能验证资助项目( 2009 B T e :夏琳(19842),女,在读硕士,主要从事大豆光周期基因克隆方面的研究。Y T :李文滨,教授,博士生导师。i K 1 :采用实时荧光定量 O (基因在不同光照条件下的果表明:早熟品种东农 49和晚熟品种东农 42各自
2、在短日照(8h/16暗 )下会比长日照(16 h/8 暗)下表达有所增强,同时东农 49中 2,它们的表达峰值均出现在光暗交界处。东农 42由长日照或短日照移入完全光或完全暗条件时,暗下 且大致维持之前长日照和短日照的表达规律。下利于其表达,并且在不同感光品种中表达有所不同。1 o M :实时荧光定量 豆; 同光照处理;差异表达 m s | : 1 D S M : A c I | : 100029841(2010)0420594204of s 50030, of in D (8 h 16 h 16 h h in 9 in 2or to a in in a in CO 豆光周期反应特性成为我国大
3、豆良种推广的难题,也给引种和杂交亲本选择带来巨大困难1。因是第 1个被证实的受节律调节影响开花时间的基因 2,是控制开花起始的关键基因之一。它位于光周期调控植物开花途径的下游,表达受生物钟的精确调控。长日照植物拟南芥中, 日条件下, 以在短日照下, 而周期途径中的下游开花基因)转录水平较低,拟南芥开花延迟;而在长日照条件下, 此时还有光照,所以长日照下的 进而引起拟南芥开花3。在短日照植物水稻中,表达模式恰恰相反4。现运用实时荧光定量 术检测光敏感性不同的大豆品种在不同光照条件下进一步从转录水平上揭示大豆而为大豆的引种、育种工作提供理论依据。1 Z 1 k 1. 1. 1 植物材料 大豆早熟品
4、种东农49和晚熟品种东农 42。1. 1. 2 试剂及仪器 2司; 荧光定量试剂 琳等: 95 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;荧光定量仪器购自. 2 k Z 2. 1 大豆叶片的取材 大豆东农 42和东农 49种植于智能人工培养箱,长日照(16 h/8 ),照度 4级,湿度 45%,温度 25e ,待第 1片三出复叶展开后, 设 2个光照处理:分别在短日照 8 h/16 )和长日照16 h/8 )条件下处理 4 d, 东农 49连续24 h,东农 42连续 48 h,每 3 氮速冻, 280 e 保存;东农 42在上述的 d,分别转移至连续光(连续暗(,连续 24 氮速冻, -
5、80 . 2. 2 大豆 考脂糖凝胶电泳检测其完整性, 紫外分光光度计测其纯度和浓度。反转录方法参照 反转录第一链 在离心管中先加入2 LL 8. 5 匀后离心, 65 e 温育 5 上冷却;加入 1 4 0. 5 L 体积为 20 匀后离心, 42070 0 . 2. 3 引物设计和评价 表 1)设计使用 . 0软件, 录号为1。V 1 ; s er 55c 9355c 214%琼脂糖检测 异性及二聚体情况,以保证定量结果的准确性。1. 2. 4 0. 2 联管(于冰上,依次加入下列反应成分: 、下游引物各0. 5 L, 离子水 6 体积为20 3次重复。荧光定量 应程序: 95e 10 s
6、, 95s, 60e 15 s, 72e 20 s, 40个循环, 72e 3 0e 上升到 95e 绘制融解曲线以判断扩增产物的正确性。1. 2. 5 数据分析 通过对 扩增效率在 95% 105%范围,采用 22$个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,荧光阈值的缺省设置是 3 15个循环的荧光信号的标准偏差的 10倍),其中 $(-(利用 据 3次重复计算标准差,验证其是否处于误差范围中。2 T s 2. 1 Q 1), 条电泳条带,均得到特异性扩增目的产物。荧光定量基因扩增产物的熔解曲线分析显示在 80 88 e 时有 1个单一的峰(图 2),荧光信号完全来自目的基因扩增产物。M: CO : m 1 y 1 m 2 y w 2 豆 科 学 4期2. 2 v y ; v H q/ V r 2. 1 不同品种在长日照和短日照下
