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1、HBV-DNAHBV-DNA 保守区保守区班级：班级：0909 生物技术生物技术 学号：学号：109116134109116134 姓名；陈雅静姓名；陈雅静【摘要摘要】 为制备 HBV-DNA 探针做准备，首先对人乙型肝炎病毒进行 S 基因的保守 区分析，获得其保守区核苷酸序列.接下来可用限制性内切酶不完全水解或 者 PCR 特异性扩增获得该基因的保守区片段。 In order to prepare HBV-DNA probes, we analyze the heron hepatitis B virus S gene to get domain sequence at first . Th
2、en we make use of restriction enzymes or PCR specificity amplification to get domain segment of S gene.【关键词关键词】 HBV-DNA,保守区，探针，乙肝诊断，PCR 特异性扩增，限制性内切酶酶切，生物信息学前言前言乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，简称 HBV）引起的 一种世界性疾病。受 HBV 慢性感染的人群患原发性肝癌（hepatocallular carcinoma Hcc）的相对危险性至少增加 100 倍。因此加强对乙肝诊断和 治疗的研究，建立和改进简便
3、、快速、灵敏、特异的早期诊断技术和指示乙 肝愈合与转阴情况，以及评估慢性携带者的检验方法，仍是我国医学病毒学 研究的重大课题。 目前，对 HBV 检测通常使用的酶联免疫吸附实验（ELISA） 。它虽然能给 我们提供较为准确的乙肝免疫指标（HBVm） ，但存在一些缺点，如免疫交叉 现象，周期长，灵敏度低等。乙肝 DNA 探针的具体用发为用一个特定的 DNA 片段制成探针，与被测的病毒 DNA 杂交，从而把病毒检测出来。与传统方法相比具有快速、灵敏的特点。传统的检测一次，需几天或几个星期的时间，精确度不高，而用DNA 探针只需一天。据报道，能从 1t 水中检测出 10 个病毒来，精确度大大提高。用
4、乙肝 DNA 探针有三个优点，首先这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。其次，DNA 探针不易降解(相对RNA 而言)，一般能有效抑制 DNA 酶活性。另外 DNA 探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR 标记法等，能用于同位素和非同位素标记。基于乙肝病毒的多种属和变异性，诊断探针必须具有普遍性才可以有效地对病毒的多种亚型及变异性进行有效诊断，这时就迫切需要获得乙肝病毒的高度保守区来满足这一需求。材料与方法材料与方法（一）寻找保守区（一）寻找保守区利用生物信息学软件 NCBI 找出人乙型肝炎病毒的部分基因，序列如下： 1 atgg
5、ggcata cccaagcaaa atcaacgaca gacaggagag tagaaggagg agaattgtta 61 ctgcaacawc tagcaggaag aatgatacct cccgagttca cgggacccat aacaacggca 121 ggaaaatttc ctaccattca acacgtgatg gatcatatag actcagtgga agaacttcgg 181 acccttcaag caggggggca ttggccggag gggacagcac gccgattggg cctagaacaa 241 ccacggccca cccctccgcc cat
6、cacgtgg acagaagaag aagacaaaaa ggccaaggag 301 ttcttcaaac aataccagga gaatcgtccg aaacccgccg agacggcacc acctcccatc 361 accgagttac acgctgcaga gcctcctcag tggaagattt caccagaaga cccgctgtta 421 aaggccaagg cgctcatccc cgtcaaggaa ccggaggtac cgatcctcaa agttccaaaa 481 ctcccgaaca aaaagaaaat gggagctacc ttcgggggaa t
7、actagctgg cctaataggg 541 ttactggtag gatttttctt gttgacaaaa attctagaaa tactgaggaa gctagactgg 601 tggtggattt ctctcagttc tccaaaggaa aaaatgctat gcggtttcca aaatactggt 661 gcccaaacct caccacatta cgtaggatcc tgcccgtggg catgcccagg atttctctgg 721 acttatctca ggctttttat catcttcctc ttgctcctgc tagtagtagc cggcttgctg
8、 781 tttctgacgg aaaacaagtc tactattttc gaaaagctcc aatgggagtc ggtctcagcc 841 ctttcctcct ccatttattc actactgcca tcggagccga aatctctagt cgctttaacg 901 tttggacttt ttcttatatg gacgacttcc tcctctgtca cccaagtgct cgtcacctta 961 actcaattag ccacgctgtc tgcacttttc ttcaagaatt cgggataa（题目：（题目：HeronHeron hepatitishepat
9、itis B B virusvirus isolateisolate D D preS/SpreS/S proteinprotein gene,completegene,complete cdscds；CDS:1-1008)CDS:1-1008)利用 NCBI 软件的 domain & structure 中的 CD-search 功能可以找到上述核苷 酸序列的保守区，结果为1 MGHTQAKSTTDRRVEGGELLLQHLAGRMIP.4.GPI.4.KFPTIQH VMDHIDSVEELRTLQAGGHWPEGT 72 点击进入可以得到整个核苷酸序列翻译所得的氨基酸序列：1 mghtqa
10、kstt drrveggell lqhlagrmip pefsgpitta gkfptiqhvm dhidsveelr61 tlqagghwpe gtarrlgldq prptpppitw teeedkkake ffkqyqenrp kpaetapppi121 telhaaeppq wkispedpll kakalipvke pevpilkvpk ltnkkkmgat fggilaglig181 llvgfflltk ileilrkldw wwislsspke kmlcafqntg aqtsphyvgs cpwgcpgflw241 tylrlfiifl llllvaagll fltenksti
11、f eklqwesvsa lsssiysllp sepkslvalt301 fglfliwtts ssvtqvlvtl tqlatlsalf fknsg（二）保守区序列的获得方法（二）保守区序列的获得方法法一：限制性内切酶酶切法一：限制性内切酶酶切在 的 NEBcutter 功能中对上述核苷酸序列进行限制性酶切位点 分析，找出符合要求的限制性内切酶。按照所需酶的作用条件对其 DNA 序列进行消化，反应条件如下：Reaction system: Buffer name: NEBuffer 2+BSA Salt: 50 mM NaCl Main: 10 mM Tris-HCl pH: 7.9 M
12、g: 10 mM MgCl2 SH: 1 mM DTT BSA: 100 样品提取液：100l Reaction temperature: 37 CReaction time: 1 hour 酶切之后对所获得基因片段进行电泳，获得所需的保守区片段。接下来可把获 得的保守区片段重组到 噬菌体中，经体外包装感染大肠埃希菌，在固体培养 基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后，将目的基因 DNA 片段再 次亚克隆到大肠埃希菌质粒中保存，以便需要时扩增。法二：法二：PCRPCR 特异性扩增特异性扩增 dNTP；Taq DNA 聚合酶；Mgd2；10buffer；特异性引物 Up primer:5
13、 atggggcata cccaagcaaa 3共 20 个碱基， Tm=10*4+10*2=60 Down primer:5 tgtccc ctccggccaa tg 3共 18 个碱基， Tm=12*4+6*2=60 PCR 扩增总体积 20ul HBV DNA 模板 2ul 10反应 buffer 2ul 4 种 dNTP 各种 1ul4 0.2mmol/L 引物 Up primer 与 Down primer 3ul2 0.5dmol/L Tap DNA 聚合酶 1ul 60 个单位/L 双蒸水 5ul 循环过程： 94 1min55 2min72 3min 循环 30 次72，保温
14、7min，反应同步设 阴性对照，取 2ul 扩增产物，用 AflIII 酶在水解缓冲液酶切，并加水至 10ul，在琼脂糖凝胶中电泳，对扩增产物进行鉴定。然后将其克隆到大肠埃希 菌的质粒中保存。结果与分析结果与分析（一）（一）寻找保守区寻找保守区保守区与整个氨基酸序列比对，可是 1-72 位氨基酸为保守区，其对应的核苷酸 序列为： 1 atggggcata cccaagcaaa atcaacgaca gacaggagag tagaaggagg agaattgtta 61 ctgcaacawc tagcaggaag aatgatacct cccgagttca cgggacccat aacaacgg
15、ca121 ggaaaatttc ctaccattca acacgtgatg gatcatatag actcagtgga agaacttcgg 181 acccttcaag caggggggca ttggccggag gggaca（二）两种方法获得的保守区序列结果（二）两种方法获得的保守区序列结果法一：酶切结果：法一：酶切结果：酶切分析结果如下图：由上图可找到剪切得到保守区序列的酶 Ecil，并可得到此酶的详细信息： Recognition site:5.5. G G G G C C G G G G A A(N)(N)1111. 333.3. C C C C G G C C C C T T (
16、N)(N)9 9. 55 Site in sequence:Ecil 酶切片段为： 1 atggggcata cccaagcaaa atcaacgaca gacaggagag tagaaggagg agaattgtta 61 ctgcaacawc tagcaggaag aatgatacct cccgagttca cgggacccat aacaacggca 121 ggaaaatttc ctaccattca acacgtgatg gatcatatag actcagtgga agaacttcgg 181 acccttcaag caggggggca ttggccggag gggacagcac gccgattggg cctagaacaa 241 ccacg法二：法二
