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1、分类号U DC密级单位代码湖南农业大学硕士学位论文Y 9 3 2 3 1 91 0 5 3 7利用转录后基因沉默( P T G S ) 防治作物黄瓜花叶病毒病S t u d yo nc o m i o lp l a n tc “c 扰聊6 盯肌D 砌纪1 ，f r “Jt h r o u g hp o s t 一仃a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g 印p r o a c h研究生姓名指导教师专业领域研究方向盘查哩型要盟基旦丞堡嗑副班童虽植物瘟翌堂擅塑痘垂堂提交论文日期2 Q Q 生旦! 目论文答辩日期2 Q Q 生旦8 目 答辩委
2、员会主席：受亘豆煎论文评阅人夏童丞耋援2戴良墓( 教援学位授予日期2 Q Q 生旦目二0 0 六年六月第一章文献综述1 植物病毒病及其防治病毒病是农作物的主要病害之一，索有植物“癌症”之称，难以防治，给农业生产造成了严重危害。据不完全统计，全世界每年因植物病毒病害所造成的产量损失约占粮食总产量的1 0 【”。许多重要病毒已遍及我国农作物的主要产区，给许多作物造成了不同程度的危害，严重影响着这些作物的产量和品质。危害作物的病毒有很多种，国际病毒分类委员会( I n t e m a t i o n a lC o m m m e eo nT a x o n o m yo f v i m s ，I c
3、 ) 于2 0 0 3 年最新发表的病毒分类第八次报告所收录的植物病毒已达9 0 9 种，分别属1 5 个科、7 2 个属。其中黄瓜花叶病毒( C “c “埘6 e r 聊D 阳f cv 扣“s ，c M V ) 是危害较大的病毒之一。c M v 是雀麦花叶病毒科( B m m o v f ，娩坩) 黄瓜花叶病毒属( c c “脚D v 扣“s ) 中的典型成员，因为其发生的普遍性和所引起病害的严重性，已成为世界性分布的重要植物R N A 病毒之一。c M V 可经8 6 种蚜虫传播埘，寄主范围很广，可以侵染1 0 0 科的12 0 0 多种植物口】。该病毒具有典型的三分体单链正义R N A
4、( + s s R N A ) 病毒的特点：基因组有3 个R N A 组份，即R N A l 、R N A 2 、R N A 3 ，还有个R N A 3 的亚基因组R N A 4 。C M V 基因组及表达产物详见图1 1 。1 a 蛋白和2 b 蛋白共同构成复制酶复合体，2 a 蛋白是依赖于鼢怆的R N A 聚合酶( R N Ad 印e n d e mR N Ap o l y m e r a s e ，R d R p ) ，与1 a 蛋白协同作用。3 a 蛋白决定病毒在植物体内的细胞间扩散。c P 亚基组成病毒粒子的外壳，起到保护核酸、长距离运输和媒介传播等生物学作用，决定病毒的症状表现M
5、。2 b 基因是近十年来新发现的c M v 基因组中与寄主植物相互作用的一个重要功能基因，其表达产物2 b 蛋白是转录后基因沉默( p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，P T G s ) 的抑制子，其存在可能是c M v 寄主范围广泛的重要原因之一 5 1 。自D 0 0 J j t t l e l 9 】6 年首次报道C M v 以来，世界各地纷纷报道该病毒的存在，已报道了1 0 0 多个c M V 株系或分离物，报道或G e n e b a I l l 【登陆的已有3 0 多个c M V 基因组的全序
6、列和约8 0 个c P 基因序列【6 吲。根锯寄主范围、血清学关系，病毒外壳蛋白肽链图谱分析、核酸杂交、R T P c R 产物酶切分析及核苷酸序列分析等，可将c M V 分成2 个性质不同的亚组【8 】，分为I 和I I 【9 】，I 亚组又可以分为I a和I b 。同一亚组株系在寄主范围、致病性等方面有一定的相似性；而不同亚组株系在寄主范围、致病性、复制及传播等方面均有差异【”。s c A P 雹鎏婆婆墅鸯善鱼鎏鎏酽a o H黔：。5 c A P 器妥鐾蕊妥窭骚娶妥鐾墼蕊娶耍瑟噩蕊釜基耍蓬蕊墨垂霪蕊蚤芏3 o H ；：；苫；二t 篇而i i 爵磊吾五五萧百丽五而茅赢而一。( 9 7K )。
7、5 胛_ 衄鼎熙熙热嘲罂掣铲掣洲髅2 tR N A d e 口e n d 档t tR N Ap o l 娜e r 譬o e2 boA Fo u o uII A q 巢枭卜蛰3 圳裟3 t5 “P _ 耋酲基量卜富蚕毒 匕3 H 要烩三m o 、7 e m e n tV 图1 1 黄瓜花叶病毒( c M v ) 的基因组及其产物参照文献 1 0 】F j g 1 1g e n o m ea dp r o d u c t so f c M Vc i t e d 疔o mI I t e r a t u r e 1 0 】目前生产上病毒病防治常用的方法有农具、土壤消毒，使用农药驱除或杀死昆虫介体，经组
8、织脱毒法获得无病毒繁殖材料及用传统育种方法引入抗性基因等【l “。这些方法都带有不同程度的弊端，例如喷施农药不仅价格高，而且造成严重的环境污染；组织脱毒法成本高、工作量大、有效期短；抗病育种存在资源贫乏，抗病基因和劣质性状基因连锁、周期长、抗性基因的遗传不稳定以及不能解决某些品种间的远缘杂交困难等。从8 0 年代初植物基因工程问世以来，科学家们就一直探索用基因工程的办法来改良作物的抗病毒特性。将病毒基因组上基因的c D N A 转化植物获取抗病毒工程植株是当前防治病毒病害的重要途径【1 2 1 。即应用来源于病原的抗性( p a l l l o g e n d c r i v e dr e s
9、 i s t 觚c e ) ，现在已经有转病毒的c P 、 护等基因成功的例子【1 3 】。但使用这种方法获得高抗转基因植物的几率较小，因而寻找一种更高效、经济的获取抗病毒转基因植株的方法已是当务之急，而植物R N A 沉默机制的揭示为我们提供了新希望【1 2 1 。2 转录后基因沉默( p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，P T G S )的发现及定义基因沉默( G e n es i l e n c i n g ) 是指生物体中特定的基因由于种种原因不表达，主要发生在两种水平上，一种是由于D N A 甲
10、基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默( t r a n S c d p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，T G s ) ，另一种是转录后基因沉默( P T G S ) 。P T G s 是指转基因在细胞核里能稳定转录，细胞质里却无相应的稳定的m R N A 存在的现象，即在基因转录后的水平上通过对靶标R N A 进行特异性降解而使基因失活。在这两种水平上引起的基因沉默都与基因的同源性有关，称为同源依赖性的基因沉默( h o m o l o g y d e p e n d e mg e n eS i l e n c i n g ，H
11、D G S ) 1 2 。基因沉默首先在转苯基苯乙烯酮合成酶( C H s ) 基因的矮牵牛( P 咖n i a ) 中发现I 坫 ，后来在其他生物中都有关于基因沉默的报道。不同领域的研究者给它作了不同的命名：植物学家称它为共抑制( c o s u p p r c s s i o n ) 或转录后基因沉默( P T G s ) 17 】；线虫和果蝇的研究人员称它为R N A 干扰( R N A i ) 【1 8 】；真菌研究者称它为消除作用( q u e l l i n g ) 旧2 0 1 。这些表面上看似不相关的现象，其实都是由同源的转基因、R N A病毒和双链砌q A 等诱导产生的一种特
12、定序列的R N A 降解机制。进一步的研究发现双链R N A ( d s R N A ) 能够高效地诱导该机制的起始1 2 l 】，随后它被一种核酶( R N a s e I )切割成2 1 2 5 n t 的小的干扰R N A ( s i R N A ) 2 2 】，其中2 1 2 3 n t 的s i R N A 与R N A 诱导的沉默复合物( R N A i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，R J s c ) 结合，共同作为引导物去选择目标R N A 并对它进行降解。植物中R N A 沉默的最显著特征是它是一种非细胞自发的过程，能够
13、局部诱导，随后通过一种可移动的信号分子扩散至整个植物组织【1 8 | 2 引。其作用表现在抵御病毒、转座子等外来核酸的入侵、识别并抑制外源基因的表达，具有维持生物基因组稳定性的重要功能【2 4 1 。目前，基因沉默已引起了广泛关注，成为分子生物学的热门领域之一【2 5 】。病毒诱导基因沉默( V i m s i n d u c e dg e n es i l e n c i n g ，V I G s ) 是由植物病毒载体感染植物引起的并启动相应的寄主中R N A 沉默的现象【2 “。病毒诱导基因沉默能有效地抑制与内源基因相关的一些生物合成途径。病毒诱导基因沉默不仅是研究基因沉默机制的热点，而且
14、还是研究植物抗病防御和植物基因功能的一种有效手段。病毒诱导基因沉默是由R N A 介导植物抗病防卫机制( R N A M e d i a t e dD e f e n s e ，R D ) 和一个相关的转录后基因沉默机制( P T G s ) 引起的。已经证明，病毒诱导基因沉默是植物抗病的可能机制 捌。许多研究逐渐认识到了R N A 介导的抗病毒性( R N A m e d i a t e dv i n l sr e s i s t a n c e ，R M V 鼬，认为具有与病毒同源序列的转基因植物，在该病毒侵入植物细胞后，同样可在转录后水平将病毒m R N A 降解田 。当没有被翻译成衣壳
15、蛋白的病毒m R N A 成功克隆到受体植株后，植株具有抵抗该病毒的抗性。而且研究人员对许多单、双子叶植物中的P 1 、G s 进行了广泛的研究。实验结果显示P T G s 与寄主植物抗病毒防卫机制密切相关。P T G s 和R M V R 具有如下共同特征：( 1 ) 均不需转基因蛋白质；( 2 ) 通常植物含有多重转基因拷贝；( 3 ) 通常与高转录率但却是低水平的转基因m R N A 相关；( 4 )通常与转基因编码区的甲基化相关【2 5 l 。近年来的研究表明，植物病毒在R N A 沉默的发生、抑制以及植物基因功能的分析中起到了重要的作用，P T G S 与植物病毒的关系己成为目前研究
16、的热点。3P T G S 的机制P T G S 是一个很复杂的过程，目前其还没有统一【2 9 】。从P T G s 应用的不同系统和不同的角度研究，人们先后提出了一系列并不能完全统一的假说1 3 0 l 。但其过程主要分为三步：起始、维持和传导。目前对P T G s 的诱发机制的解释有三种模型，即R N A 阈值模型、异常R N A 模型、双链R N A 模型【3 1 。在这一系列模型中R N A 起着非常重要的作用，它不仅是P T G s 现象的启动因子，同时也是P T G S 作用的靶分子【强J 。不论何种诱发因素，所导致的R N A 沉默最后都汇集到d s R N A 产生后对同源性较高的目标基因的m R N A 降解这一过程上。3 1R N A 阈值模型( R N At l l r e s h o l dm o d e l )该模型认为，由于激发了外源基因的高水平转录，以至于积累到某个阈值，从而启动了降解特定m R N A
