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1、中国农业大学硕士学位论文利用农杆菌通过花器浸蘸法转化小麦的研究姓名：李广旭申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：李延军;潘申权2002.6.1摘要根癌农杆菌( A g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 已被广泛用于双子叶植物 遗传转化，但是却比较难以转化单子叶植物特别是具有重要经济价值的小麦、 玉米和水稻等。农杆菌介导拟南芥转化的花器浸蘸法( f l o r a ld i p ) 是当前不 需要组织培养或植株再生的最简单的转化方法。我们将该方法应用于小麦的转 化，通过G U S 报告基因系统详细的探讨了影响G U S 瞬时表达频率的
2、因素，并有 分子证据表明外源基因已经整合进小麦的基因组中，初步建立了通过花器浸蘸 法利用农杆菌转化小麦的体系。在本研究中，农杆菌菌株L B A 4 4 0 4 ( p T O K 2 3 3 ) 用来对处于花期的小麦穗部进 行浸蘸处理，其含有一超双元载体p T O K 2 3 3 ，在其T D N A 区携带有g u s 报告基 因和潮霉素磷酸转移酶基因( 助幻，我们在不同处理条件下对小麦花器的G U S 瞬时表达频率进行了研究，并根据G U S 的瞬时表达频率确立了适宜的接种条 件。结果表明，适宜的接种时期应在小麦开花前2 天至刚见花；接种菌液的 O D 6 0 0 值应0 7 5 至0 9
3、 之间；接种菌液的P H 值应在5 8 左右；浸蘸时间以5 分钟为宜i 保湿时间以2 4 小时较为合适。在供试的七个品种中均检测到了较 高的G U S 瞬时表达频率。、在对花器浸蘸处理后3 0 天，我们挑取供试品种的胚进行G U S 组织学染色， 结果，在繁七、鄂恩1 号、京冬8 号四个品种上出现了蓝斑，其染色频率分别 为2 5 0 、2 5 9 、2 6 9 、2 9 2 ，带菌检测显示胚部不带农杆菌，这表明T - D N A 可能已经整合到小麦的基因组中，G U S 基因得到了稳定的表达。此外，我们将 胚放在含有潮霉素的愈伤诱导培养基上，结果诱导出了少量的愈伤组织，这进 一步证实了T D
4、N A 的整合。我们对胚G U S 染色出现蓝斑的四个品种进行潮霉素的抗性筛选却没有得 到转化体，但在T 。代幼苗上检测到了G U S 活性。通过P C R 的方法我们从三个 品种的总共7 株T 。代幼苗上扩增出了特异性条带，其中鄂恩1 号两株、京冬8 号两株、9 3 1 11 三株。以p T O K 2 3 3 质粒T D N A 区助t 基因为探针对七个出现 特异性条带的D N A 样品的点杂交结果均为阳性，说明T - D N A 已经整合到小麦的 基因组中，鄂恩l 号、京冬8 号和9 3 1 1 1 转化频率分别是1 9 6 、1 9 5 、2 8 6 。， 本研究证明了利用农杆菌通过花
5、器浸蘸法能够转化小麦。麦烨杆农癌根法蘸浸器花键A b s tr a e tA g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sh a sb e e nw i d e l yu t i l i z e da sav e c t o rf o rp l a n tg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ，p a r t i c u l a r l yo nd i c o t y l e d o n o u sp l a n t s M o n o c o t y l e d o n o u sp l a n t s
6、，e s p e c i a l l ye c o n o m i c a l l yi m p o r t a n tg r a m i n a c e o u sc r o p ss u c ha sw h e a t ，r i c ea n dc o r n ，h o w e v e r , a l em o r er e c a l c i t r a n tt oA g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n T r a n s f o r m a t i o no fA r a b i d
7、 o p s i st h a l i a n ab yf l o r a ld i po fA g r o b a c t e r i u mi st h es i m p l e s tt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d ，f o rt h a tp l a n tt i s s u ec u l t u r i n go rr e g e n e r a t i o ni s n tr e q u i r e d B yf l o r a ld i p p i n gw h e a te a r sw i mA g r o b a c t e r
8、 i u m t h ef u n c t i o n a l i t yo ft h i sm e t h o dw a se v a l u a t e di no u rs t u d y T h eo b j e c t i v e so ft h i ss t u d ya l et ou n d e r s t a n dt h ef a c t o r si n f l u e n c i n gt h ee f f i c i e n c yo fG U St m n s i e n te x p r e s s i o na n de s t a b l i s h m e
9、n to fw h e a tt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mm e d i a t e dw i t hA g r o b a c t e r i u m W h e a tp l a n t sw e r ei n o c u l a t e du n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n sa n da td i f f e r e n ts t a g eo ff l o r a ld e v e l o p m e n tb yd i p p i n gt h e i re a r si ni n
10、o c u l u m so fA g r o b a c t e r i u ms t r a i nL B A 4 4 0 4h a r b o r i n gas u p e rb i n a r yv e c t o rp T O K 2 3 3c o n t a i n i n gt h e1 3 - g l u c u r o n i d a s eg e n e ( g u s A ) w i t ha ni n t r o n ，a n das e l e c t a b l em a r k e r , t h eh y g r o m y c i np h o s p h
11、o t r a n s f e r a s eI Ig e n e ( h p t ) T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a li n o c u l a t i o nt i m ew a sa b o u t2d a y sb e f o r ei n f l o r e s c e n c et of e wo p e nf l o w e r so ft h ew h e a te a r sa n dt h a tt h eh i g h e s te f f i c i e n c yo fG U St r a n
12、 s i e n te x p r e s s i o nW a sa c h i e v e d 、 ，i t l lp l a n t si n o c u l a t e df o r5m i n w i t hA g r o b a c t e r i u mw i t ha nO D 6 0 0r a n g i n gb e t w e e n0 7 5 - 0 9a n dp Ha t5 8f o l l o w e db ym a i n t a i n i n gh i g hh u m i d i t yf o rt h ef i r s t2 4h o u r sa f
13、t e ri n o c u l a t i o n v e r yh i g he f f i c i e n c yo fG U St r a n s i e n te x p r e s s i o nW a sd e t e c t e di na l lm es e v e nc u l t i v a r st e s t e d E m b r y o sf r o mw h e a ts e e d s3 0da f t e rf l o r a l d i pw i t hA g r o b a c t e r i u mw e r ea s s a y e df o rG
14、U Sa c t i v i t y F o u rw h e a tc u l t i v a l ss h o w e dc l e a rb l u es p o t so nt h e i re m b r y o sa tt h ef r e q u e n c yo f2 5 0 f o rF a n q i ，2 5 9 f o rE e n1 ，2 6 9 f o rJ i n g d o n g8 ，a n d2 9 2 f o r9 3 111 N oa g r o b a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o mt h e s ee
15、 m b r y o s T h i si n d i c a t e dt h a tT - D N Aw a si n t e g r a t e di n t ow h e a tg e n o m ea n dt h eb l u es p o t so nw h e a te m b r y o sw e r ec a u s e db yG U Ss t a b l ee x p r e s s i o n B yi n c u b a t i n gt h ee m b r y o so ne a l l i i n d u c i n gm e d i u mc o n t a
16、 i n i n gh y g r o m y c i nf o rs e v e r a ld a y s ，l i t t l ec a l l iw a si n d u c e d ，a l s oi n d i c a t i n gt h ei n t e g r a t i o no f T D N Ai np l a n tg e n o m e S e e d so ft h e4c u l t i v a r ss h o w i n ge m b r y oG u sa c t i v i t yw e r ei n c u b a t e do nm e d i u mw i t hh y g r o m y c i n N or e s i s t a n tt r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e do u t H o w e v e r , G u sa c t i v i t yw a
