实验讲义doc - 化学院实验教学中心色谱质谱仪器组

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1、时间就是金钱，效率就是生命！唯有惜时才能成功，唯有努力方可成就！内标法测定奶茶中香兰素的含量一、实验目的 1.了解气相色谱法的基本原理及仪器结构. 2.了解气相色谱基本仪器操作. 3.掌握内标法的配样与计算方法.二、实验原理 内标法内标法：在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除出于 操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱柱所分离，又不受 试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可 求出待测组分在样品中的百分含量。内标物内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，和 被分

2、析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发 度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。 当然，内标物必须能与样品中各组分充分分离并不发生反应。m样品的质量；样品的质量； ms待测样品中加入内标物的量；待测样品中加入内标物的量； As待测样品中内标物的峰面积；待测样品中内标物的峰面积； fs,i组分组分 i 与内标物的校正因子之比，称为相对校正因子与内标物的校正因子之比，称为相对校正因子香兰素香兰素（Vanillin） ，又名香草醛，分子式： C8H8O3，CAS 号： 121-33-5，分子量: 152.15，为一种广泛使用的可食

3、用香料或医药中间体，本实验采取内标法测定奶茶中香兰素的含量。三、仪器与试剂 Agilent 6890N 气相色谱仪，10ul 进样针，移液枪； 香兰素储备样（称取香兰素 0.5022g，以氯仿定容到 50ml 容量瓶） ； 2-甲氧基苯酚储备样（称取 2-甲氧基苯酚 0.4987g，以氯仿定容到 50ml 容量瓶） ； 香兰素未知样，氯仿。四、实验步骤 1、配置标准溶液、配置标准溶液：以移液枪量取 100，200， 300，400ul 香兰素储备液 和 200，200， 200，200ul 2-甲氧基苯酚储备液 于 5ml 容量瓶中，用氯仿定容。%100AmfAmx sis,is i时间就是金

4、钱，效率就是生命！唯有惜时才能成功，唯有努力方可成就！2、配置未知溶液、配置未知溶液：以移液枪量取 200ul 香兰素未知液和 200ul 2-甲氧基苯酚储备液于 5ml 容量瓶中，用氯仿定容。 3、设定气相色谱参数、设定气相色谱参数：进样口：气化温度：250， 分流比：10:1；色谱柱：流速：2.0ml/min;柱温箱：120（保持 1min） ，10/min 升到 200检测器：基座温度：250，H2：45ml/min,Air:450ml/min,N2:40ml/min. 保存。 4、进样：以以上方法测定标样及未知样，记录实验数据（保留时间及峰面积） 5、做出内标标准曲线，以内标法计算未知

5、样中香兰素含量。进样应注意的问题进样应注意的问题：GC 中手动进样技术的熟练与否，直接影响到分析结果的好坏，正确的进样手法是：取样后，一手持注射器(防止气化室的高气压将针芯吹出)，另一只手保护针尖（防止插入隔垫时弯曲） 。先小心地将注射针头穿过隔垫，随即快速将注射器插到底，并将样品轻轻注入气化室（注意不要用力过猛使针芯弯曲） ，同时按 start 键，拔出注射器，注射样品所用时间及注射器在气化室中停留的时间越短越好。 另外，在进多个不同样品时，每次进样前都要将进样针润洗干净，确保洗针溶剂不干 扰样品检测。五、数据处理t(内标/min)t(香兰素/min)A（内标）A（香兰素）C（香兰素）/ C

6、（内标）A（香兰素）/ A（内标）标样 1标样 2标样 3标样 4未知样六、结果与讨论 1.你做出来的标准曲线相关系数是多少？你觉得操作过程中有哪些地方会带来误差？ 有哪些操作或参数还可以优化？2.比较归一化法，外标法和内标法各自的优缺点。3.你对本实验有什么意见或建议吗？液相色谱仪分离测定奶茶、可乐中咖啡因一、 实验目的 （1）了解高效液相色谱仪（以安捷伦 1100、1260 为例）的结构及基本操作。 （2）了解色谱分离的基本原理，尤其是反相色谱的基本规律。时间就是金钱，效率就是生命！唯有惜时才能成功，唯有努力方可成就！（3）掌握色谱的基本定性、标准曲线定量方法。二、实验原理 咖啡因又称咖啡

7、碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称 1，3，7-三甲基黄嘌呤，是由茶叶或 咖啡中提取出的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约 1.2%1.8%，茶叶中约为 2.04.7%。可乐饮料、APC 药片均含咖啡因。 本实验采用的是液相色谱中的反相分配色谱，反相色谱用的是非极性填料分析柱（如 ODS-C18） ，流动相是极性较强溶剂（如甲醇和水） ，样品根据在固定相和流动相中的分配 系数不同而进行分离。通过标准样品的保留时间进行定性，以峰面积对浓度绘制的工作曲 线定量。三、仪器与试剂1. . 仪器仪器 Agilent 1260 型液相色谱仪：真空在线脱气装置；四元梯度泵；多波长检测器；

8、 ODS-C18 柱；超声器（用于样品溶解，流动相脱气，玻璃器皿清洗） 。2. . 试剂试剂 甲醇（色谱纯） ；水（超纯水） ；咖啡因标样；奶茶；可乐。四、实验步骤1. . 确定实验条件确定实验条件 打开计算机，等计算机启动完毕后，依次打开输液泵、真空在线脱气装置、柱温箱、 检测器的开关。通讯完毕后，设定操作条件。流动相： 甲醇/水60/40 ；总流速 0.5mL/min 设定在 254nm 波长下进行检测，柱温 30，流动相的比例可以根据实验内容的 需要在控制单元中修改。2. . 样品制备样品制备 将可乐、奶茶倒入烧杯后放在超声波仪中超声脱气，去除奶茶、可乐中溶解的空气以 及大量二氧化碳气体

9、。将脱气后的可乐溶液稀释 5 倍后，通过 0.45m 的滤膜过滤，转移 至定量管中备用。将脱气后的奶茶溶液用甲醇稀释 5 倍后、离心，取上层清液通过 0.45m 的滤膜过滤后，转移至定量管中备用。 准确称量 10mg 的咖啡因用甲醇溶解于 10ml 的容量瓶中作为母液，再分别从母液中移 取 0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL 溶液至容量管中，然后分别稀释至 10mL。 3. 样品测定样品测定 （1）流动相比例设为甲醇/水60/40，依次将咖啡因标准溶液进样 5L（利用六通阀 进样器的定量管进行准确定量） ，以得到咖啡因在此色谱条件下的保留时间以及各个浓度下 咖啡因的峰面积。 （2

10、）将未知浓度可乐、奶茶溶液进样 5L，以获得此溶液中咖啡因的保留时间及峰面 积。4. . 关机关机 用纯甲醇冲色谱柱约半小时，观察基线平稳后，可在工作站上关闭输液泵，柱温箱、监 测器，然后关闭工作站，再依次关闭仪器上监测器、柱温箱、输液泵的电源开关。关闭计 算机。五、数据处理由步骤 3 获得的各标准溶液的实验结果，绘制峰面积-浓度标准曲线，再根据步骤 4 测时间就是金钱，效率就是生命！唯有惜时才能成功，唯有努力方可成就！得的值，从曲线上查出未知咖啡因溶液的实际浓度。六、 思考题 （1）反相分配色谱的分离原理是什么？ （2）液相色谱的优缺点？实验 18 毛细管电泳仪分离测定雪碧、芬达中苯甲酸钠一

11、、实验目的时间就是金钱，效率就是生命！唯有惜时才能成功，唯有努力方可成就！（1）了解毛细管电泳仪（以安捷伦 7100 为例）的结构及基本操作。 （2）了解毛细管电泳分离的基本原理。 （3）掌握色谱的基本定性、外标法的定量方法。二、实验原理 苯甲酸钠是苯甲酸的钠盐，无味或略带安息香气味，在空气中十分稳定，易溶于水， 由于比苯甲酸更易溶于水，比苯甲酸更常用与工业生产。但有研究显示，苯甲酸类具有叠 加毒性作用，普遍已改用山梨酸盐作为防腐剂。 电泳指带电粒子在电场作用下作定向运动的现象。电泳有自由电泳和区带电泳两类， 区带电泳是将样品加于载体上，并加一个电场。在电场作用下，各种性质不同的组分以不 同的

12、速率向极性相反的两极迁移。利用样品与载体之间的作用力的不同，并与电泳过程结 合起来，以期得到良好的分离。因此，电泳又称电色谱。本实验通过使用毛细管电泳法对 饮料中苯甲酸钠含量进行定性定量测量，得出了饮料中苯甲酸钠的含量。三、仪器与试剂1. . 仪器仪器 Agilent 7100 型液相色谱仪；2. . 试剂试剂 1.0 mol/L 氢氧化钠溶液；20 mmol/L PH=9.3 硼酸钠溶液；雪碧滤液（脱气后经 0.45m 滤膜过滤） ；芬达滤液（脱气后经 0.45m 滤膜过滤） 。四、实验步骤1. . 确定实验条件确定实验条件 打开计算机，等计算机启动完毕后，打开毛细管电泳仪电源开关。通讯完毕

13、后，设定 操作条件：分别在进样盘中放入相应的溶液：1、NaOH 溶液；2、纯水；3、空； 4、5、6、硼酸钠溶液；7、空；8、废液。 CE 平衡步骤： 第一步，设定 inlet 为 1 号位置，outlet 为 8 号位置冲洗 300 秒。 第二步，设定 inlet 为 2 号位置，outlet 为 8 号位置冲洗 300 秒。 第三步，设定 inlet 为 6 号位置，outlet 为 8 号位置冲洗 300 秒。Method Parameter CE(Default Settings)：Vials Inlet home vial 4 Outlet home vial 5Cassette T

14、emperature20.0 High Voltage System Enable high voltage Voltage 0.0V Current 300A时间就是金钱，效率就是生命！唯有惜时才能成功，唯有努力方可成就！Power 6.0 W Low current limit OFFStoptime 10.0 minutesPosttime OFFReplenishment Replenishment and preconditioning parallel processing No replenishment usedCE Conditioning Flush inlet 6 Via

15、l, outlet 8 Vial for 5 minutesCE Injection Inject by pressure,50 mbar,4 secondsTimetable Change voltage 0.2 minutes,30 kV2. . 样品制备样品制备 将雪碧、芬达倒入烧杯后放在超声波仪中超声脱气，去除饮料中溶解的空气以及大量 二氧化碳气体。脱气后的雪碧、芬达溶液通过.45m 的滤膜过滤后，转移至进样瓶中备用。称量 0.2g 的苯甲酸钠，用 20 g/L 的 NaHCO溶液加热溶解于 10ml 的容量瓶中，再从 中移取 2.5mL 溶液至 50ml 容量管中定容作为母液。再分别

16、从母液中移取 2mL、4mL、6mL、8mL、10mL 溶液至 25mL 容量瓶中定容。3. . 毛细管电泳仪样品测试参数毛细管电泳仪样品测试参数 Method Parameter Replenishment Replenishment and preconditioning parallel processing No replenishment usedCE Conditioning Flush inlet Home Vial, outlet Out Vial for 5 minutesCE Injection Inject by pressure,50 mbar,4 secondsTimetable Change voltage 0.2 minutes,30 kV 4.4.样品测定样品测定时间就是金钱，效率就是生命！唯有惜时才能成功，唯有努力方可成就！（1）把苯甲酸钠标准液放置于进样盘 11、12、13、14、15 位置处测试，并获得保留时 间及峰面积。 （2）