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1、琼脂糖凝胶电泳回收琼脂糖凝胶电泳回收 PCRPCR 产物产物一原理 DNA 片断的分离与回收是基因工程操作中的一项重要技术，例如可收集特定酶切 片断用于克隆或制备探针，回收 PCR 产物用于再次鉴定等。回收实验中两个最 重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、 标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会大大增加前期的工作量。 本实验采用的是 V-GENE 公司的 DNA 凝胶回收试剂盒，其原理是：在凝胶融化液 （Buffer DE-A）中凝胶块被迅速融化并释放出 DNA。加入高离液序列溶液 （Buffer DE-B）后 DNA 片断被选择性吸附到 silica 膜上。
2、经 Buffer W1、Buffer W2 洗涤去除残留在 silica 膜上的杂质和高浓度盐离子后，吸附到 silica 膜上的 DNA 片断经微量水或 Eluent 洗脱下来，即可用于各种分子生物学 实验。二材料与方法 1 材料 PCR 产物（未经纯化） 2 仪器、用具 电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、微波炉、台式离心机、移液器、恒温孵育器 （55-65）、1.5ml 离心管 3 试剂 1TAE 电泳缓冲液；溴化乙锭溶液（EB）有毒，小心操作 ；琼脂糖；6加 样缓冲液；NJ 缓冲液；DNA 洗脱缓冲液；SPW 洗涤缓冲液 2.4 方法 (1) 按常规方法于 2%琼脂糖凝胶进行电泳。 (2) 在
3、紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。 (3) 称量凝胶重量，以 1mg=1l 换算凝胶体积。 (4) 加入 3 个凝胶体积的 NJ 缓冲液 (5) 悬浮均匀后于 55-65加热 7min，期间每 23min 摇晃一次，直至凝胶 块完全融化。 (6) 把 DNA琼脂糖溶液加到一个 Mu-Pu DNA 回收纯化柱上，并把柱子装在一干 净的 2ml 收集试管内，14000rpm 离心 1ml，弃去流出液。 *对于体积大于 700l 的样品，则分别加到不同的柱子上，每次 700l。 (7) 用 700l 无水乙醇稀释的 SPW 洗涤缓冲液洗涤柱子，加入柱子中后静置 2- 3min。室温下 14000rpm 离心 1min。 (8) 弃滤液，以同样的方法再洗涤一次。 (9) 把柱子装在一个灭菌干净的 1.5ml 离心管上，加入 30-50l 的 DNA 洗脱缓 冲液或无菌去离子水到柱基质上，14000rpm 离心 1min 以洗脱出 DNA。 (10) 取 3l 样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。 注：PCR 产物的纯化选用直接纯化法还是胶回收法主要取决于 PCR 产物。若 PCR 产物电泳时为单一条带，可采用直接纯化法，即将酶、dNTP 等多余物质去掉便 可；若 PCR 产物电泳时为多条带，则要根据需要回收特定条带，此时须选用胶 回收法。
