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1、1单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的 B 淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫 B 细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在 HAT 培养基含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)中进行选择性培养，未融合的脾细
2、胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成 DNA 的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成 DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在 HAT 培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2 培养箱、倒置显微镜等。四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原
3、性较强的抗原。A可溶性抗原（蛋白质） 以 1mg/ml5mgml 的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为 0.3ml0.6ml，间隔周再同样注射一次，天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合2试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原 0.2ml0.4ml，天后，杀死小鼠取脾做融合用。B. 颗粒性抗原 如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以浓度每只皮下注射.ml，每周次，共免疫次，取脾前天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫动物；目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，
4、尤以小白鼠为好。就品系而言以 Balb/c 小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从 Balb/c 小白鼠系诱导出来。Balb/c 系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以 812 周龄为宜。大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠大鼠，小鼠人以及人人杂交瘤技术。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的 B 淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生 1.01075.0107 种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤
5、的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的 B 淋巴细胞大量增加。B 淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的 B 淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后 78 天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；脾细胞制备(1) 免疫过的血清抗体滴度高的 Balb/c 鼠，拉颈或用 CO2处死小白鼠。(2) 将小鼠放于 70酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。(3) 把脾放入 5ml 含有 2.5FCS 的 1640 液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球
6、。3(4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。(5) 直立小试管 3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。(6) 以 2.5FCS1640 充满离心管，并以 400g 离心 7min10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。(7) 把沉淀用约 10ml 的新鲜培养液再悬浮。(8) 重复、步骤。(9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于 80为合格。骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。选择骨髓瘤细胞的条件：该瘤细胞
7、系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生 球蛋白或不分泌到细胞外；骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好 106 个细胞/ml；生长速度快，繁殖时间短。目前常用的 Balb/c 小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：S194/5XXOBU1；SP20Ag14（简称 SP2）；P2X？ Ag8653（简称 653）；FO以 653 最为常用，它是由矿物油 4甲基15 烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并经过培育形成一株 8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由
8、有关单位直接引入，保存于-195液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入 15g/ml 8氮鸟嘌呤。取约 11076107对数生长期（即培养 15h20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以 2.5FCS1640 液再悬浮并计数。饲养细胞4在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此
9、在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如 C57 鼠，昆明小白鼠等。（1）拉颈处死小鼠。（2）70酒精浸泡消毒 10min。（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。（4）用注射器将 4ml 11.6蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉 1min 仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。（
10、5）1 000rmin 离心 10min。（6）取上清，以 HAT 选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含 40 万个活细胞。（7）以 1ml 吸管将细胞种入微量培养皿，每孔 0.05ml，含 2 万个细胞，放入 CO2 培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。4、细胞融合； 小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的 B 淋巴细胞在一般培养某中不易存活。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的 B 淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下产生
11、融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有 B 淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在 HAT 选择培养基中可以选择得到杂交细胞。这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量5繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某 B 淋巴细胞产物单克隆抗体。（1）、取末次免疫后的第 3 天小鼠脾细胞悬液，将 108 小鼠脾细胞与 1-5107SO2/O 小鼠骨髓瘤细胞混合于 50 毫升刻度离心管中，经 1000 转/分离心 7 分钟；（2）、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置 37水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；3）、将 37水浴中保温的
12、 50%PEG1.0 毫升（实际应用 0.7 毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在 60 秒钟内滴完，在 37水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；4）、加完 PEG 后，将细胞悬液放在 37水浴中静置 90 秒钟，立即在 24 分钟内加入 15 毫升无血清的 RPMI-1640 培养基（37），开始要一滴一滴地加，由于稀释使 PEG 停止作用。注意尽可能不搅动细胞；5）、再经 100 转/分离心 10 分钟。弃去上清液，加 25 毫升 HAT 培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个 24 孔培养板中，每孔 0.5 毫升；6）、将培养板放在水蒸汽饱和 CO2 孵箱中，37孵育。C
13、O2 含量为 5%；7）、每 23 天换一次 HAT 培养液，连续 2 周观察杂交瘤细胞是否出现。2 周后使用 HT 培养基。5、杂交瘤细胞的选择培养；6、杂交瘤细胞的筛选； 7、杂交瘤细胞的克隆化；8、单克隆抗体的检定；9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；10、单克隆抗体的大量制备。五、关键步骤与注意事项：1、整个制备过程需严格无菌2、细胞传代培养时注意适时更换培养液杂交瘤细胞的大量繁殖6克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞
14、具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的 1001 000 倍。利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。1材料（1）经高压灭菌的降植烷。（2）Balb/c 鼠：58 周龄。（3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。（4）RPMI1640 培养液（5）新生牛血清2操作方法(1) 于小鼠腹腔注射 0.5ml 降植烷，注射后周内种植细胞。(2) 收
15、取对数生长期的杂交瘤细胞，用FCS1640 液洗涤一次，1 000r/min 离心 10min。(3) 取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用FCS1640 液配成 1.0107 细胞/ml 的悬液。(4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射 1ml（含 1.0107个细胞/ml）。7(5) 接种后 10 天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔 13 天取 1 次，可取 10 次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。单克隆抗体的提纯1材料(1) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl 缓冲液20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L pH7.87.
16、9TrisHCl 缓冲液40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl 缓冲液80 mMol/L NaCl(4) 20mMol/L pH7.87.9TrisHCl 缓冲液(5) 饱和硫酸铵液(6) DEAE纤维素柱2操作方法（1）小鼠腹水用冷 PBS 液稀释 4 倍后，于 1.00105 转离心 30min，去沉淀。（2）在 4于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为 50硫酸铵浓度。（3）此溶液置冰中 30min60min，然后 5 000r/min 离心 10min，去上清。（4）将沉淀溶于 TrisHCl 缓冲液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混浊）。（5）装入透析袋于 TrisHCl 缓冲液（20 mMol/L NaCl）中透析除盐。（6）离心去沉淀。（7）溶液稀释（1:100 或
