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1、内蒙古医学院硕士学位论文Semaphorin3B抑制肿瘤作用的新机制探索姓名：张嘉玲申请学位级别：硕士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：苏秀兰;毕力夫20080501内蒙古医学院学位论文原创性声明郑重声明：本人所呈交的学位论文是在导师指导下，独立进行研究所取得的研究成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文内容不包含其他个人或集体已经公开发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人学位论文与资料若有不实，愿意承担一切相关的法律责任。 论文作者签名蕊叁砂名年珀日学位论文版权使用授权书本人完全了解学院有关保留、使用学位论文的规定，同意学院保留并向
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3、，am e 出e ro fd 器s3S e m a p h 0 I i n 8 ，i sat u m o rs u p p r e s s o r C o m p e i t i o n 诮t hV E G F l 6 5 ( V 鹊c u l a re n d o t l e l i a lg r o 讪f 如t o r ) e X p l a j n sap o r t i o n0 ft h ea c t i 、r i t ) r ，w h e r e 嬲t h eV E G F i n d e p e n d e n tm e c h a n i s mw a Sn o te l u
4、c i d a t e d O b j e c t i v e ：T oe x p l o r ea n di d e n t i f yan o V e lp a t l l w a yo fS E M A 3Bi nt h et u r n o rs u p p r e s s i v ee f f e c t M e t h o d sW ee r n p l o y e dam i c r o 廿r a ya n ds c r e e n e df o rt h eg e n e so fw h i c he x p r e s s i o nw a si n c r e a s e
5、db yS E M A 3Bi nN C I H l2 9 9c e l l s W 毛t h e ni n v e s t i g a t e dw h e t l l e ra n db yw h a tm e c h a n i s m 出ei d e n t i f i e dg e n e ，a c t e da sa ne f e c t o ro fS E M A 3 B R e s u l t s ：( 1 ) N C I H 1 2 9 9c e l l st 啪s f e c t e d 埘t l lS E M A 3 Bg e n ec a ne X p r e s so
6、 b v i o u s l yh i 曲e rI G F B P 一6 ( 2 ) I n h i b i t i o no fI G F B P 一6b ys i R N Ad i m i n i s h e dt h es u bG o G 1p o p u h t i o nt h a tw 鹊i n d u c e db yS E M A 3B I n s u l i n l i k eg r o 砒hf a c t o r t h a ta I l t a g o n i z e sI G F B P 一6p a I t l ya b 玎) g a t e dt h ee f f
7、e c t ( 3 ) T 1 1 el e V e lo fp c a t e n i ne x p r e s s e do nc e U sm e m b r a n ed e c r e 髂e d 锄ds h o w e dac h a n g eo fl o c a l i z a t i o ni ns t a b l yt r 锄s f e c t e dS E M A 3 Bo fN C IH 1 2 9 9c e U I n t r o d u c t i o no fB c a t e n i ni n t ot 1 1 es t a b l ye x p r e s so
8、 fS E M A 3 Bo fN C I H 1 2 9 9c e l l sp 砌l ya b r o g a t e dt l l eg r o 汕s u p p r e s s i V ee 能c to fS E M A 3 B W ec o 眦l u d e dt h tt l l es e m 印h 面ns i g l l 幽n ga n dp c a t e n i ns i 印a l i n gc o n v e l l g eo nI G F B P 一6a I l da n t i t h e t i c a l l ya f f e c tt l e i rf u n c
9、 t i o n s I G F B P 一6i st h ee f f e c t o r0 ft u r I l o rs u p p r e s s o ra c t i V i t ) ro fS E M A 3Bi nN C I H 1 2 9 9c e U s K e yw o 础；S E M A 3 B ，I G F B P 一6 ，p c a t e n i n ，t u m o rs u p p r e S s i n gS e m 印h 面n 3 B 抑制肿瘤作用的新机制探索S e m 印h o r i n s 蛋白家族参与细胞的迁移。并与神经细胞再生1 1 、肿瘤形成2
10、| 、心脏血管的形态形成3 1 、免疫应答4 1 等过程相关。S e 即h o r i n s 3 包括7 个家族成员，依次为S E M A 3 A S E M 奶G ，均属分泌型蛋白。其蛋白活性通过与N R P ( N e u m p i l i I l 8 ) 受体、P l e x i 璐受体结合而发挥作用 5 6 】。s E M A 3 E 是唯一与P 1 e x i n s 受体直接结合而发挥效应的蛋白【| 。V E G F 。5 是V E G F 基因选择性剪接表达产物，与N R P 受体，V E G F R 2 受体形成V E G F l 6 5 一N R P V E G F R
11、2 传导信号【8 9 1 。因此，N f u P 为s E M A 3 一N R P p l 耐n 信号通路和V E G F l 6 5 一N R P V E G F R 2 信号通路的共享受体，s E M A 3 与V E G F 通过竞争N R P 受体而相互制约【l0 | oS E M A 3 B 具有肿瘤抑制的活性。在肺癌研究中S E M A 3 B 的表达常因启动子区域甲基化而被抑制。S E M A 3 B 基因位于染色体3 p 2 1 3 区域，此区域在肺癌发生中常常伴有染色体杂合性缺失1 1 ，1 2 】。p 5 3 中介其下游响应因子可诱导S E M A 3 B 的表达1 3
12、1 。有关S E M A 3 B 抑制肿瘤作用的研究，仅发现S E M A 3 B 通过与V E G F 6 5 竞争结合N R P l 受体抑制肿瘤血管的形成使肿瘤细胞凋亡途径引。新近的研究显示S E M A 3 家族中S E M A 3 A 和S E M A 3 F 的信号传导通路较为复杂oS E M A 3 A 抑制V E G F 活性的机制存在依赖与非依赖竞争结合受体的途径 1 5 1 。p c a t e -I l i n T C F 信号也参与S E M A 3 F 的细胞生长抑制通路n 引。因此我们推测S E M A 3 B 的抑癌机制有可能存在除与V E G F 。舒竞争受体外
13、的其它通路。我们的研究拟探索并鉴定S E M A 3 B 抑癌作用中的未知通路。有些肿瘤抑制基因是通过诱导效应基因的表达而发挥功能1 7 埘】。我们假设S E M A 3 B 为肿瘤抑制基因，利用表达谱基因芯片技术筛选出了转染S E M A 3 B 后表达显著增加的基因一I G F B P 一6 ，同时分析了I G F B P 一6 是否为s E M A 3 B 的效应基因。1 实验材料1 1 细胞株肺癌细胞株H 1 2 9 9 ，P C I 4 ，A 5 4 9 ，P C 3 ，P C 9 ，L C 2 A d ，L l 2 ，L C 一，S B C 3 ，S B C 5 ， L C M S
14、 ，P C 7 ，L K | 7 9 ，工) M S 9 2 ，A d 2 ，S q l ，L C A D L ，L C L 购自A T C C ( A 埘l e I i c a n 蛳C u l t u r eC o U e c t i o n ) 或J C R B ( J a p a n e s eC o l l e c t i o no fR e s e 剖陀hB i o r e s o u r c e s ) o1 2 主要试剂的配制凼塞直医堂睦亟婴塞垒堂垡迨塞( 兰塑! 生2( 1 ) 1 0 P B S 储存液1 0 0 0 l I l l ：N a C l8 0 9K C L2
15、9N a H P 0 4 7 H 2 01 1 5 9K H 2 P 0 42 9( 2 ) 5 0 7 r A E 电泳缓存液储液1 0 0 0 I I l l ：s 碱2 4 2 9N a 2 E D I A 2 H 2 03 7 2 9冰乙酸5 7 1 I l l l( 3 ) 转膜缓存液：s b 鹄e2 5m MG l y c i n e1 9 2m M2 0 m e t h a n o l( 4 ) L u 血一B e r t 击n 液体培养基1 0 0 0 r I l l ：B a c t o t 卯t o n e1 0 0 9B a u c t o e x t r a c t5
16、O gN a C l1 0 O g ( 5 ) 配制4 p 础如肿a l d e h y d e ：P 觚如肿a l d e h y d e2 9H 2 0 ( 6 0 )4 0 I l d1 0 NN a H O6 u l在冰上冷却，加5 玎dl O P B S ，用N a O H 调p H 至7 4 ，定容至5 0 I I l l 。1 3 主要仪器设备( 1 ) 离心机：M x 一1 5 0 ，T o M Y ( 低温高速) ；V 一7 0 ，K u B O T A ( 普通低速) ；研A 一M I N I ，D e n v e rI n s t l l l m e n t ( 2 ) 凝胶分析仪：U V P G D S 一7 9 0 0 ，U V PI I l c ( 3 ) 普通P C R 仪：G e m e A m p 一9 7 0 0 ，A B II n c
