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1、质粒质粒 DNA 的提取、定量、酶切与的提取、定量、酶切与 PCR 鉴定鉴定一、实验目的一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。二、实验原理二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制 DNA，使目的 DNA按 2n方式呈指数形式扩增
2、。 PCR 一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至 95，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（3570,一般低于模板 Tm 值的5左右），与模板 DNA 互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温 72，在 Taq 酶作用下，以 dNTP 为原料，引物为复制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒 DNA 的提取与制备(1).碱裂解法：染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体 DNA 和质粒 DNA 均变性；B.当以高盐缓冲液调节其 pH 值至
3、中性时，变性的质粒 DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒 DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。3.质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长 2
4、80nm 的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反应 DNA 的纯度；A260/A280=1.8 DNA 纯净A260/A2801.8 含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。4.质粒 DNA 的酶切鉴定：限制性内切酶是 DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA 序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链 DNA。 5.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA
5、 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的 DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、材料与方法：三、材料与方法： （一）实验材料：（一）实验材料：1.PCR仪器：PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液【大肠杆菌 DH5a 菌株(pMD19-T 质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白 GFP)】、无菌去离子水、2Premix Taq、引物2. 质粒 DNA 的提取与制备仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf
6、管、微量加样枪、离心管材料：溶液 P1（S1）、溶液 P2 (S2）、溶液 P3（S3）、去蛋白液 PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脱液 EB（Eluent)、含 pMD19-T 质粒的大肠杆菌 DH53. 质粒 DNA 的定量（紫外分光光度法）仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸馏水、质粒4.质粒 DNA 的酶切鉴定仪器：1.5ml 的 EP 管、微量加样枪材料：无菌水、10M 酶切缓冲液 Buf R、质粒 DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、
7、DNA Marker 5000、电泳缓冲液（二）实验方法（二）实验方法1. .PCR2. . 质粒质粒DNA的提取与制备的提取与制备准备目的 DNA：菌液煮沸 10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液取 0.2 ml PCR 反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水5.5l、2*Premix Taq12.5l、引物 1 (10 mol/L) 1l、引物 2 (10 mol/L) 1l、菌液 5l将装有 PCR 反应体系的 PCR 反应管放入 PCR 仪上进行如下操作：94预变性 5 分钟后开始以下循环 循环为 9430 秒，5030 秒，72 1 分钟。循环为 30 次 72
8、5 分钟 4 保温取 1.5ml 培养物加入 Eppendorf 管中将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中13000rpm x 1min，弃上清将 PCR 反应管置台式离心机中瞬时离心3. 质粒质粒DNA的定量（紫外分光光度法）的定量（紫外分光光度法）加入 250l 溶液 S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮加入 250l 溶液 S2，颠倒 46 次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮加入 350l 溶液 S3，立即温和混匀 68 次。13000rpm 离心 10min，小心取上清液（500-800l ）将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm 离心
9、3min，弃滤液加入 500l 去蛋白液(W1)，13000rpm 离心 1min，弃滤液向吸附柱中加入 700l 漂洗液 W2， 13000rpm 离心 1min ，弃滤液；重复一遍操作空柱 13000rpm 离心 1min，然后室温放置 3min，使残留乙醇挥发取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加 50l 洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置 1min，13000rpm 离心 1min 洗脱质粒 DNA， -20保存备用清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿加入适量的蒸馏水刷洗，23 次。并用滤纸擦拭干净空白对照比色测定 向比色皿加入 98ul 蒸馏水，进行 Blank 调零再向
10、比色皿加入 2ul 的质粒 DNA，于紫外分光光度计上进行sample测定，记录相关数据4. .质粒质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定5.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳四、结果与讨论：四、结果与讨论： （一）实验现象1.加入溶液 P1，出现悬浮现象；2.加入溶液 P2,温和混匀，溶液会变得清亮；在一个洁净的 1.5mlEP 管中按顺序依次加入下述试剂 无菌水 9.0l、10M 酶切缓冲液 2.0l、 质粒 DNA 7.0l、 Hind III (15U/ul) 1.0l、 EcoR I (12U/ul) 1.0l小心混匀试剂，将 EP 管置于恒温水浴箱中 371.5 小时。取质粒 DNA、经酶切反应
11、后的 DNA 片段和 PCR扩增的 DNA 各 6l 于三个 EP 管中并做好标记往每个 EP 管中加入 1lGelview 染料，室温放置一分钟用微量加样枪分别各吸取 10ul，按序号加入到电泳仪的凝胶孔中电泳 30 分钟取出凝胶紫外光下观察，拍照3.加入溶液 P3,有白色絮状沉淀生成；4.电泳时，可观察到在电流作用下，点样的溶液出现电泳现象，电泳速度不同。在紫外检测仪条件下，可以观察到不同的物质出现不同的电泳带。（二）实验结果原始实验数据测量次数 质粒 DNA 浓度（ug/ml） Ratio 比值(A260/A280) 1 148 1.46 2 106 1.523 115 1.45平均值
12、123 1.47电泳后的图片A:PCR 目的条带 B:酶切片段C:质粒 DNA（四）实验分析1.由上数据可知，Ratio=1.47 A260/A2801.8 表明样品中含有较多的蛋白质（芳香族）2. 在图片中，其他三类 DNA 与 Maker 相比较，可知质粒 DNA 的分子大小在 2500bp-3500bp，酶切反应的质粒 DNA 片段分子大小在 2800-3000bp 和 400-500 左右，PCR 的DNA 分子大小在 400-500bp。基本符合预期。（四）实验讨论1.质粒 DNA 中出现三条带，分别对应超螺旋质粒 DNA、线性 DNA 和开环状质粒 DNA。这三种不同构型的分子有不
13、同的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋型，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从上到下分别为：超螺旋型 DNA、线性分子、开环状分子。,2.对于实验结果中：A260/A2801.8 的可能原因为：A.在质粒 DNA 的提取实验的“取上清液”步骤中吸入沉淀导致引入较多的蛋白杂质，进而导致后续实验中因蛋白质量较多而难以去除。B.可能为试剂污染引起杂质蛋白的引入。3.实验中需注意的事项：用微量加样枪加试剂时，同种试剂可以不用换吸头，每次换不同试剂时要记得换一个新吸头。在 PCR 中，如果配好的反应液较多沾到管壁上，要将 PCR 反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后
14、才将反应管放到基因扩增仪上。在质粒 DNA 提取的实验中，加入溶液 S2 时，时间不能太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次。在电泳实验中，点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。在电泳中，Geldview 有毒，切勿用手接触。思考题：（1）碱裂解法提取质粒时，溶液 I、II、III 的作用分别为？答：溶液 I：螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对 DNA 的降解作用；有利于溶酶体的作用。溶液 II：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液 III：酸性条件下质粒 DNA 复性，变性蛋白-SDS+线性 DNA 沉淀，Na+可中和 DNA。（2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？答：尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。酶量的选择任何时候 2 种酶的总量不能超过反应体系的 1/10 体积，而且最大反应体系最好不要小于 20 ul，且酶切反应中甘油浓度应低于 5%。底物 DNA 的纯度：主要污染 DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应应尽量纯化底物。反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如 NaCl 和 Mg2+, 合适离子强度可以激发酶切反应。
