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1、1细菌细菌 -淀粉酶产生菌种筛选淀粉酶产生菌种筛选来源：生物信息网来源：生物信息网一实验目的1掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。2巩固以前所学的微生物学实验技术。3学习淀粉酶活性的测定方法。二. 实验原理-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。1、采样：即采集含菌的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物
2、的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。2、增殖培养（又称丰富培养）增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。3、纯种分离在生产实践中，一般都应
3、用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平2板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。4、性能测定分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。复筛是在初
4、筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。 三实验材料1、小铁铲和无菌纸或袋。2、无菌水三角瓶（300mL 的瓶装水至 99mL，内有玻璃珠若干）3、无菌吸管（1mL，5 mL 等）4、无菌水试管（每支 4.5mL 水）5、无菌培养皿 6、分离培养基 蛋白胨 1%； NaCl 0.5%； 牛肉膏 0.5%； 可溶性淀粉 0.2%；琼脂1.5%；pH7.2；水定容。注：先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到溶化好的培养基中，
5、调匀。7、Lugol 氏碘液：碘 1 克，碘化钾 2 克，水 300 毫升配制时先将碘化钾溶于 5-10 毫升水中，再加入碘，溶解后定容。8、麸曲培养基：麸皮 7 克； 玉米面 1 克； (NH4)2SO4 0.04 克 (4%(NH4)2SO4 加 1mL)；NaOH 0.08 克(8%NaOH 加 lmL)；3水 10mL，混合均匀，装入 250-300mL 三角瓶中，15 磅灭菌 30 分钟。9、碘原液：碘 2.2%； 碘化钾 0.4%； 加水定容。10、标准稀碘液 取碘原液 15mL，加碘化钾 8 克，水定容 200mL。11、比色稀碘液 取原碘液 2mL，加碘化钾 20mg，定容至
6、500mL。12、0.2%可溶性淀粉液 称取 0.2 克可溶性淀粉，先以少许蒸馏水混合，再徐徐倾入煮沸蒸馏永中，继续煮沸 2 分钟，冷却，加水至 100mL。13、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 pH6.0。称取 Na2HPO412H20 11.31 克，柠檬酸 2.02 克，加水定容至250mL。14、标准糊精液称取 0.3 克糊精，悬浮于少量水中，再倾入 400mL 沸水中，冷却后，加水稀释至 500mL。 冰箱存放。 四实验方法：1、分离纯化采集土样样品稀释：在无菌纸上称取样品 1g，放入 100mL 无菌水的三角瓶中，手摇10 分钟。80水浴 15 分钟，冷却。用 1mL 无菌吸管吸取 0.
7、5mL 注入 4.5mL 无菌水试管中，梯度稀释至 10-6。 分离：用稀释样品的同支吸管分别依次从 10-6、10-5、10-4 样品稀释液中，吸取 lmL，注入无菌培养皿中，然后倒入灭菌并融化冷至 50左右的固体培养4基，小心摇动冷凝后，倒置于 35温箱中培养 48 小时。检查：培养 48 小时后，取出平板，将皿中注入 l 滴 Lugol 氏碘液，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有无色圈，说明该菌能分解淀粉。纯化：从平板上选取淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的菌落，用接种环沾取少量培养物至斜面上，并进行 2-3 次划线分离，挑取单菌落至斜面上，培养后观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。2、夫曲
8、培养取纯化菌落斜面中加入 5 毫升无菌水制成菌悬液，取 2 毫升接种至夫曲培养基中，搅均后，36培养 24 小时。3、酶活测定 制备酶液在已成熟的夫曲三角瓶中，加水 100mL，搅匀，置 30水浴 30 分钟，用滤纸过滤，滤液即细菌 -淀粉酶液，待测。 在三角瓶中，加入 0.2%可溶性淀粉溶液 2mL，缓冲液 0.5mL，在 60水浴中 10 分钟平衡温度，加入 3m1 酶液，充分混匀，即刻记时，定时取出一滴反应液于比色板穴中，穴中先盛有比色稀碘液，当由紫色逐渐变为棕橙色，与标谁比色管颜色相同，即为反应终点，记录时间（t） ，单位为分钟。计算：淀粉酶活力单位=（60/t）20.2%f/3（f/t） 式中 f 是酶的稀释倍数。1 克或 1mL 酶制剂或酶液于 60，在 1 小时内液化可溶性淀粉的克数表示淀粉酶的活力单位克/克(或毫升)小时。注意：淀粉液应当天配制使用，不能久贮。测定液化时间应控制在 23 分钟内。
