酶工程复习要点(华农)

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1、酶工程酶工程:又称酶工艺，是围绕酶所特有的催化特性使其在工业、农业、医疗等方面发挥作用的应用技 术。-核心问题为酶制剂的生产和应用酶稳定性酶稳定性: :是指酶分子抵抗各种因素的影响，维持其生物活性的能力。1.热稳定性2.酸碱稳定性3.抗蛋白酶稳定性4.抗氧化剂稳定性5.抗重金属稳定性6.抗表面活性剂稳定性7.贮运稳定性半衰期半衰期:是指一定条件下（温度、pH 值等）酶制剂丧失50%活力所需的时间。酶的化学组成酶的化学组成1.单纯酶2.结合酶-酶蛋白-辅因子：酶活性中心的组成部分/连接底物和酶分子的桥梁/稳定酶蛋白的构像酶的结构特征酶的结构特征一级结构： 组成酶蛋白的氨基酸的种类、数目和排列顺序

2、。二级结构：一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷 曲等结构。三级结构：在二级结构的基础上进一步进行分子盘曲形成具有一定规律的三维空间结构。四级结构：由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链聚合而成特定构像的蛋白质分子。基本键：基本键：（1）肽键：维持一级结构的基础。 （2）二硫键：增加了酶分子结构的刚性和有序性。（3）氢键：维持二级结构的基础。（4）疏水键： 酶分子折叠成空间结构的主要作用力。（5）离子键：对酶分子稳定性作用显著。提高酶的稳定性提高酶的稳定性：a.体外改造(1)酶的固定化(2)酶的化学修饰(3)改变酶存在的微环境b.体内改造(4)遗传修饰工

3、程(5)菌种的选育酶活力单位酶活力单位1.习惯单位a.在最适条件下，每分钟吸光值变化0.01所需的酶量为1Ub.在最适条件下，每分钟底物转化的量或生成产物的量 mol/min2.国际单位a.在最适条件下（最适底物浓度、pH 等） ，每分钟转化1mol 底物或生成1mol 产物所需的酶量 为1个国际单位（1U）b.在最适条件下（最适底物浓度、pH 等） ，每秒钟能使1 mol 底物转化为产物所需的酶量为1Kat酶活力的表示方式酶活力的表示方式（1）酶的转化数（Kcat）：每一活性中心或每分子酶在单位时间内所能转化的底物分子数。（2）酶的比活力（U/mg 蛋白）：指每毫克蛋白所具有的活力单位数。（

4、3）U/g 酶制剂：表示酶制剂中的酶活大小。（4）U/mL 酶液：表示液体酶中的酶活大小。（5）U/g 鲜重或干重：表示某种材料中的酶活大小。酶活力的测定方法酶活力的测定方法A.按原理分终止法： 将酶促反应进行一定时间后终止反应。动力学法：用仪器检测酶促反应过程中光吸收、电位、黏度等的变化。B.按检测手段分直接测定法 ：直接检测底物或产物的变化。间接接测定法：将底物或产物转化成稳定可检测的 物质。酶偶联测定法：使用一指示酶，使第一个酶的产 物转变成可测定的新产物。产酶菌株的要求产酶菌株的要求1.不是致病菌；2.菌株不易变异和退化；3.发酵周期短，产酶量高；4.所产的酶易于分离和提取；5.对医药

5、和食品用酶，还应考虑安全性。菌种的筛选菌种的筛选(1)含菌样品的采集:根据目的酶作用的底物及特性。(2)富集 :通过物理、化学或生物的方法使产目的酶微生物大量繁殖，以利筛选(3)产酶菌株的筛选:稀释法和划线法(4)菌株的优化:提高产酶能力； 减少或消灭共存的不需要的酶、色素或其他物质； 变产酶菌株的代谢，使目的酶成为组成型酶，消除代谢产物及终产物对酶的阻遏。 菌种的保存低温保藏砂土保藏液体石蜡油封法冰冻干燥法微生物产酶的生产流程微生物产酶的生产流程：菌种的活化种子培养发酵酶的提取培养基：培养基：是人工配制的，适合微 生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。培养基的设计原则培养基的设计原则选择适宜

6、的营养物质;营养物的浓度及配比合适;物理、化学条件适宜;经济节约;精心设计、试验比较;设计培养基应考虑的问题设计培养基应考虑的问题培养基成分的来源及成本水的质量通气搅拌所需动力大小发酵管理是否方便能否使微生物生长良好且产酶量高后处理的难易所产的酶是组成型的还是诱导型的酶的生成是否受分解代谢物和产物阻遏的影响pHpH 影响微生物产酶原因：影响微生物产酶原因：影响细胞中各种酶的活性和目的酶的稳定性；影响细胞膜上的电荷； 影响培养基中某些成分分解和中间代谢产物的解离；影响培养基的氧化还原状态。液体深层培养法液体深层培养法1。优点设备占地面积小；生产可以自动化；生产可以机械化。2.缺点需要高度净化的无

7、菌空气；需要密闭良好的发酵罐；需要科学合理的管道安装；需要消费大量的电力。提高酶产量的方法提高酶产量的方法：常通过控制微生物的遗传功能及控制培养环境，使某种酶或代谢产物过量生产1.选育优良的产酶细胞株系a.筛选组成型酶生产菌株b. 筛选抗分解代谢的突变株（分解代谢物阻遏）c.筛选抗反馈阻抑突变株（末端产物阻遏）2.添加产酶促进剂3.控制阻遏物的浓度酶生物合成的模式酶生物合成的模式(1)同步合成型（生长偶联型）-酶的合成与细胞生长同步(2)延续合成型-酶的合成伴随着细胞生长而开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一 段时间。(3)中期和成型-酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而进入细胞

8、平衡期之后，酶合成终止。(4)滞后合成型-酶开始合成及大量积累在细胞生长进入平衡期之后。细胞生长：细胞生长：延迟期、指数生长期、减速期、静止期、衰亡期简答题：简述在酶制剂工业生产中，如何克服微生物的调节机制使某种酶或代谢产物过量生产。简答题：简述在酶制剂工业生产中，如何克服微生物的调节机制使某种酶或代谢产物过量生产。细胞工程产酶细胞工程产酶：指在特定的反应器中通过培养动植物细胞获得所需的酶植物细胞培养产酶优点植物细胞培养产酶优点：1.生产是在可控制的条件进行的；2.可排除病原菌和虫害的影响；3.与植物生长周期比，大大缩短了生长周期；4.可以进行特定的生物转化反应和探索新的合成路线；5. 能够完

9、成蛋白的翻译后修饰。植物细胞培养的工艺流程：植物细胞培养的工艺流程：外植体的选择与处理，细胞的获取，细胞培养动物细胞培养的工艺流程：动物细胞培养的工艺流程：原代培养物的制备，原代细胞培养，传代细胞培养动物细胞培养方式：动物细胞培养方式：贴壁培养、悬浮培养、微载体培养系统、包埋培养、微囊化培养生物酶工程生物酶工程:又称为高级酶工程，是酶学与以 DNA 重组技术为主的分子生物学技术相结合的产物。用基因工程技术大量生产酶；修饰酶基因，产生遗传修饰；设计出新酶基因,合成自然界从未有过的酶。克隆酶克隆酶：利用 DNA 重组技术大量生产的酶，称为克隆酶如何生产克隆酶：如何生产克隆酶：目的酶基因的获得表达载

10、体的选择目的基因与载体的连接重组 DNA 的转化表达宿主的选择转化转化：外源 DNA 进入受体细胞并使它获得新遗传特性的过程成为转化。突变酶：突变酶：据现有的有关酶（蛋白）结构与功能的知识，按照预定目标通过核苷酸置换、插入或删除， 定点改变酶基因，从而生产出性能更稳定、活性更高的酶，此类酶叫突变酶 定点突变的方法定点突变的方法 盒式诱变：用一段新合成的双连 DNA 取代目的基因上两个比较靠近的限制性核酸内切酶位点之间 的片段。寡核苷酸引物诱变 ：PCR 诱变a.特殊位置碱基的定点突变.需突变碱基位于基因的末端.唯一限制性位点删除法.扩增环状质粒全长的突变方法b.重组 PCR 定点诱变法（OE-

11、PCR）c.大引物 PCR 法酶分子的定向进化酶分子的定向进化：在体外模拟自然进化过程（随机突变、基因重组、定向选择或筛选） ，使基因发 生多种变异，最后定向选择或筛选出所需性质或功能的酶，该策略称为酶分子的定向进化或酶分子 的非合理设计定向进化的过程：定向进化的过程：通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性；导入适当载体后构建突变文库；通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子酶分子定向进化常用的技术酶分子定向进化常用的技术易错 PCR DNA 改组体外随机重组法交错延伸法过渡横板随机嵌和生长技术抗体酶：抗体酶：是一类免疫系统产生的、具有催化活性的抗体。本质：免疫球蛋白。在其可变区域具有酶 的

12、 属性。核酶核酶：有酶的催化特征，本质上不是蛋白质而是核酸的分子定义为核酶脱氧核酶脱氧核酶：是利用体外进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链 DNA 分子。杂合酶杂合酶：把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，可以产生具有所需性质 的优化酶杂合体。化学人工酶化学人工酶：指利用有机化学、生物化学等方法设计和合成的一些能模拟酶对其底物结合和催化过 程的非蛋白质分子或蛋白质分子人工全合成酶小分子有机物全合成酶人工聚合物酶胶束模拟酶人工半合成酶：它是以天然蛋白或酶为母体，用化学或生物学的方法引进活性部位或催化基团， 或改变其结构分子印迹：分子印迹：是制备与某一化合物（

13、模板分子）选择性结合的聚合物的过程。印迹酶：印迹酶：是指通过分子印迹技术产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合与催化作 用的人工模拟酶。酶的分离纯化酶的分离纯化：是指将酶从细胞或其它材料中提取出来，再与杂质分开，获取符合使用目的、有一 定纯度和浓度的酶制剂的过程原理原理：利用明显区别于原材料中其它蛋白质的物理、化学特性1.大小2.形状3.电荷4.等电点5.溶解度6.非寻常性质7.疏水性8.配体结合能力9.金属结合能力10.特异性序列或结构11.翻译后修饰12.纯化标记酶分离纯化的基本过程酶分离纯化的基本过程原材料的选择与处理细胞破碎 酶的提取酶的粗提液 酶的分离纯化酶的浓缩与干燥酶

14、的提取：酶的提取：是指在一定条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使其充分溶解到溶剂或溶液中 的过程沉淀分离沉淀分离：是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，与其它 溶质分离的技术（硫酸铵盐析法实验室最常用的盐析法）过滤分离：过滤分离：是指借助于过滤介质，将混合液中的固相与液相及相对分子量大小不同的物质进行分离 的技术。膜膜：是指在一种流体相内或是在两种流体相之间有一层薄的凝聚相，它把流体相分隔为两部分，并 能使这两部分之间产生传质作用膜过滤：膜过滤：又称为膜分离技术。是借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同形状和不同特性的物质颗粒 或分子进行分离的技术。反渗透：反

15、渗透：是在选择性膜浓度高的一侧施加大于渗透压的压力，利用膜的筛分性质，使浓度较高的溶 液进一步浓缩的技术电场膜分离：电场膜分离：指在膜的两侧分别装上正极和负极，在电场作用下，带电的小分子物质或离子向着与 其本身所带电荷相反的电极移动，透过膜，从而达到彼此分离的目的。离心分离：离心分离：是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程萃取：萃取：是指一个液相中的部分溶质转移至另一液相的过程。超临界流体萃取超临界流体萃取：是利用欲分离物质与杂质在临界流体中溶解度的不同而达到分离的一种萃取技术。层析分离：层析分离：亦称色谱分离，是利用混合物中各组分的物理化学性质及生物学特性

16、的不同，使各组分 以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流 动相)并使各组分以不同速度移动，从而使不同的组分分离。电泳：电泳：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。迁移率（迁移率（U U）：）：是指带电分子在单位电场强度（E）下的移动速度（） 。酶分子的修饰：酶分子的修饰：在体外通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能 的技术过程称为酶分子修饰。为什么要进行酶分子修饰为什么要进行酶分子修饰1.研究与应用 酶学研究的需要2.天然酶的稳定性不够好3.酶的活性不够高4.异源酶分子具有较强的抗原性5.改善酶分子的溶解特性等。酶分子修饰的方法酶分子修饰的方法：A. 分子生物学方法：采用基因定点突变技术改变基因的编码核苷酸，使酶分子的组成和结构发生变 化获得具有新的特性和功能的酶分子。 B. 生物化学方法：采用酶学方法有控制地去掉酶分子的非活