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1、PCR 实用技巧实用技巧 350784478(金币+2,VIP+0):感谢分享 7-13 15:43增加 PCR 的特异性： 1. primers design 这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件 a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量 b. GC% 40%60% c. 5端和中间序列要多 GC,以增加稳定性 d. 避免 3端 GC rich, 最后 3 个 BASE 不要有 GC,或者最后 5 个有 3 个不要是 GC e. 避免 3端的互补, 否则容易造成 DIM
2、ER f. 避免 3端的错配g. 避免内部形成二级结构 h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到 5端, 在算 Tm 值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们 i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在 3端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度(1uM-3uM) j. 最好学会使用一种 design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al. * 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm） 。这是当 50的引物和互补序列表现为双链 DNA 分子时的温度.
3、Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从 55到 70。退火温度一般设定比引物的 Tm 低 5。 设定 Tm 有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于 18 碱基的引物。 有的是根据 GC 含量估算 Tm。确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm 会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的 Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过
4、分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的 Tm5，以 2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。 为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm 值。引物对的 Tm 差异如果超过 5，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物 Tm 不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5 或者为了提高特异性，可以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环，然后在根据较低 Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。2. stability of primers 定制引物的标准
5、纯度对于大多数 PCR 应用是足够的。 引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在 TE 重溶引物，使其最终浓度为 100M。TE 比去离子水好，因为水的 pH 经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20。以大于 10M 浓度溶于 TE 的引物在 -20可以稳定保存 6 个月，但在室温（15到 30）仅能保存不到 1 周。干粉引物可以在-20保存至少 1 年，在室温（15到 30）最多可以保存 2 个月。 3. optimize reactants concentration a. magnesiom ions M
6、g 离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响 Polymerase 的活性，一般的情况下 Mg 的浓度在 0.5-5mM 之间调整，同样要记住的是在调整了 dNTPs 的浓度后要相应的调整 Mg 离子的浓度，对实时定量 PCR，使用 3 到 5mM 带有荧光探针的镁离子溶液 b. 其他的离子 NH4+ K+都会影响 PCR，增加 K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了 PCR 的 严谨性(stringency)，NH4+也有相同的作用. MBI 公司的 TAQ 酶就提供了两种 BUFFER, 一种是加 Mg 的一种是已经混合了(
7、NH4)2SO4 的，当然, 过高的阳离子浓度(KCL0.2M)时, DNA 在 94 度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起 PCR 了. c. polymerase 不同公司的酶效有所不同,需要 operator 自己掌握适合的酶的浓度，一些高保真没的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情况下, 变性的温度可以使用9092 度, 变性的时间也可以缩短,从而保证 polymerase 的活性 d. template 50ul PCR SYSTEM = human gDNA 0.1ug-1ug E.Coli 10ng-100ng Lam
8、adaDNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng = 4. termperature a. denaturation 常规是 94 度 5 分钟, GC Rich 的摸板是 95 度 5 分钟 除了 GC Rich 外, 常规的 APPLICATIONS 可以将这部分时间缩短到 1 到 2 分钟, 或者在 CYCLE 1 时给予较长的时间,而取消开始的 denaturation b. annealing 重点到了：一般情况下, 是从 55 度开始.根据情况配合以 Mg 离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在 30-60S, 时间
9、短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 annealing temp.时也会有一些活性. 所以在 A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险，另外,在对于一些困难户, 比如从 gDNA 里扩增大片段, 还可使用 two step PCR. 5. touchdown PCR 原理很简单,但的确是一个很有用的方法。举个例子，ANNEALING TEMP. 55 度 94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s72 1min 2cycles94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s
10、 51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s 72 1min 20cycles 72 5min 6. hot start PCR 热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一。尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行 PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如 site-directed 突变、表达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启
11、动 PCR 尤为有效。 限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR 反应液，并将其置于预热的 PCR 仪。这种方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成，直到 PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入 Taq DNA聚合 酶，在反应体系达到 90 度时，PAUSE，将温度保持在 70 度以上，手工加入 polymerase，但这个方法 过于烦琐， 尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本 成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开
12、。在热循环时， 因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。 = ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer) Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega) Magnesium wax beads (Stratagene). =象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。 还有一种方法是使用 inactive DNA Polymerase. polymerase 被抗体抑制失活，当变性温度超过 70度时，抗体也变性了，这样 polymerase 又被激活了。 7. Booster PCR
13、我们知道 1ug human genomic DNA 大约在 3X10 5 幂个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于 100 个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个 booster PCR 我一直找不到合适的词来翻译这个booster. 具体是这样的.开始几个 cycles 保持 primer 的低浓度,保证 primer:template 的 molar ratio 在 10 7 10 8. 以确保开始扩增的准确性.然后 booste Primer 的浓度到正常的水平 8. 循环数和长度 确定
14、循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.因为过多的循环数容易造 成 ERRORS 和非特异性产物的积累 产物的量不够, 优化的方法有: 1. 增加 TEMPLATE 2. 增加循环数 如何确定循环数,有一个方法. 做一个 PCR 体系,40 循环,50ul, 分别在 20,25,30,35 循环时从体系中取 5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数 另一个会影响 PCR 特异性的是 PCR cycling 时在两个温度间变化的速率(ramping rate).当然是越高 越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台 PCR 仪,也没有多少挑选的余地 9. thermal
15、 cycler PCR 仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整 PCR 仪,以保证其能够到达正确的温度.现在的 PCR 仪基本上都有自检功能(self-diagnosis). 10. PCR additives 附加物或者说 enhancer 实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率的化学因子, DNA 结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配, 增加产物的长度和产量. 在 GC Rich 情况中, additive 可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另一种情况下,additive 由于造成错配的 primer-tem
16、plate 复合物的极大的不稳定, 而提高了扩增的忠实性.要注意的是,没有万能的 enhancer 全部通用,需要你根据自己的情况,最好结合 gradient pcr 选择最优条件. = dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10% formamide at 5% trimethylammonium chloride 10-100uM detergents such as Tween 20 0.1-2.5% polyethylene glycol (PEG)6000 5-15% glycerol 10-15% single stranded DNA binding protein
