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1、实验三实验三 食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）（50095-2003 食品中蛋白质含量测定）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。三、仪器与试剂（一）试剂1、硫酸铜（Cu
2、SO45H20） 2、硫酸钾3、硫酸（密度为 1.8419g/L）4、硼酸溶液（20g/L）5、氢氧化钠溶液（400g/L）6、0.01mol/L 盐酸标准滴定溶液。7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液 1 份，与 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液 5 份临用时混合。8、黄豆粉。（二）仪器微量定氮蒸馏装置：如图 3- 所示。图 3- 微量凯氏定氮装置1、电炉； 2、水蒸气发生器（2L 平底烧瓶） ；3、螺旋夹 a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处） ；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹 b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。四、实验步骤1、样品消化称取黄豆粉约 0.3g（0.001g）
3、，移入干燥的 100mL 凯氏烧瓶中，加入 0.2g 硫酸铜和 6g 硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入 20mL 浓硫酸，将瓶以 450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加 20mL 水，放冷后，无损地转移到 100mL 容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至 100mL，得试剂空白消化液。2、定氮装置的检查与洗涤检查微量定氮装置是
4、否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。测定前定氮装置如下法洗涤 23 次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子 a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子 b 由橡皮管排出，如此数次，即可使用。3、碱化蒸馏量取硼酸试剂 20mL 于三角瓶中，加入混合指示剂 23 滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹 a 关闭，螺旋夹 b 开启的状态下，准确吸取 10.0mL 样品消化液，由小漏斗流入反应室，并以 10mL 蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒
5、状玻塞塞紧。使 10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹 a，关闭螺旋夹 b，开始蒸馏。通入蒸汽蒸腾 10min后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏 2min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。同时吸取 10.0mL 试剂空白消化液按上法蒸馏操作。4、样品滴定以 0.01mol/L 盐酸标准溶液滴定至灰色为终点。5、数据记录项 目第一次第二次第三次样品消化液（mL）滴定消耗盐酸标准溶液（mL）消耗盐酸标准溶液平均值（mL）五、结果计算100 101000140. 0)(21 FmcVVX式
6、中 X样品蛋白质含量（g/100g） ；V1样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL） ；V2空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL） ；c盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L） ；0.0140 1.0mL 盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量（g） ；/000. 1)(LmolHClcm样品的质量（g） ；F氮换算为蛋白质的系数，一般食物为 6.25；乳制品为 6.38；面粉为 5.70；高梁为 6.24；花生为 5.46；米为 5.95；大豆及其制品为 5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为 5.83；芝麻、向日葵 5.30。计算结果保留三位有效数字。六、注意事项及说明1、本法也适用于半固体
7、试样以及液体样品检测。半固体试样一般取样范围为2.00g5.00g；液体样品取样 10.0mL25.0mL（约相当氮 30mg40mg） 。若检测液体样品，结果以 g/100mL 表示。2、消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。3、消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。4、硼酸吸收液的温度不应超过 40，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。5、在重复
8、性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%七、思考题1、预习凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作。2、蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？3、在蒸汽发生瓶水中、加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸的作用是什么？若在蒸馏过程中才发现蒸汽发生瓶中的水变为黄色，马上补加硫酸行吗？4、实验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些？小学常用歇后语1.八仙过海-各显神通 2.不入虎穴-焉得虎子3.蚕豆开花-黑心 4.车到山前-必有路5.打破砂锅-问到底 6.和尚打伞-无法无天7.虎落平阳-被犬欺 8.画蛇添足-多此一举9.箭在弦上-不得不发 10.井底青蛙-目光短浅11.
9、大海捞针-没处寻 12.竹篮打水-一场空13.打开天窗-说亮话 14.船到桥头-自会直15.飞蛾扑火-自取灭亡 16.百米赛跑-分秒必争17.拔苗助长-急于求成 18.仇人相见-分外眼红19.芝麻开花-节节高 20.新官上任-三把火21.瞎子点灯-白费蜡 22.兔子尾巴-长不了23.偷鸡不成-蚀把米 24.王婆卖瓜-自卖自夸25.老虎屁股- 摸不得 26.老虎拉车-谁敢27.老鼠过街-人人喊打 28.麻雀虽小-五脏俱全29.墙上茅草-随风两边倒 30.三十六计-走为上计31.塞翁失马-焉知祸福 32.壶中无酒-难留客33.丈二和尚-摸不着头脑 34.有借有还-再借不难35.猫哭耗子-假慈悲 3
10、6.铰子破皮-露了馅37.扁担挑水-一心挂了两头 38.对牛弹琴-白费劲39.八仙聚会-神聊 40.霸王敬酒-不干也得干41.板上订钉-跑不了 42.背鼓上门-讨打43.草把做灯-粗心（芯） 44.竹笋出土-节节高45.菜刀切豆腐-两面光 46.钉头碰钉子-硬碰硬47.高山上敲鼓-四面闻名（鸣） 48.铁打的公鸡-一毛不拔49.关公走麦城-骄必败 50.狗咬吕洞宾-不识好人心51.鸡蛋碰石头-不自量力 52.姜太公钓鱼-愿者上钩53.脚踏西瓜皮-滑到哪里是哪里 54.孔夫子搬家-净是书55.老鼠钻风箱-两头受气 56.留得青山在-不怕没柴烧57.门缝里看人-把人看扁了 58.泥菩萨过河-自身难
11、保59.泼出去的水-收不回 60.骑驴看唱本-走着瞧61.千里送鹅毛-礼轻情意重 62.肉包子打狗-有去无回63.山中无老虎-猴子称大王 64.司马昭之心-路人皆知65.外甥打灯笼-照旧（舅） 66.王八吃年糕-铁了心67.王小二过年-一年不如一年 68.小葱拌豆腐-一清二白69.小和尚念经-有口无心 70.周瑜打黄盖-两厢情愿71.赶鸭子上架-吃力不讨好 72.擀面杖吹火- -一窍不通73.瞎子戴眼镜-装饰 74.猴子捞月亮-空忙一场75.秀才遇到兵-有理讲不清 76.三个臭皮匠-顶个诸葛亮77.黄牛追兔子-有劲使不上 78.和尚训道士-管得宽79.过年娶媳妇-双喜临门 80.聋子见哑巴-不闻不问六字短语81.铜钣上钉铆钉-一是一，二是二 82.里弄里扛竹竿-直来直去83.苦水里泡黄连-苦上加苦 84.驴唇不对马嘴-答非所问85.猪鼻子里插葱-装象 86.只许州官放火-不许百姓点灯87.猪八戒照镜子-里外不是人 88.放风筝断了线-没指望了89.池塘里的风波-大不了 90.关门掩着耗子-急（挤）死91.顶风顶水划船-硬撑 92.东北的二人转-一唱一和93.东洋人戴高帽-假充大个 94.到火神庙求雨-找错了门95.鲁班门前耍斧-有眼无珠 96.老太太吃汤圆-囫囵 吞97.出太阳下暴雨-假情（晴） 98.挂羊头卖狗肉-虚情假意99.担着胡子过河-谦虚过度 100.唱歌不看曲本-离谱
