《苹果中多酚氧化酶特性的测定不完全2》由会员分享，可在线阅读，更多相关《苹果中多酚氧化酶特性的测定不完全2（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 有关于苹果中多酚氧化酶的有关于苹果中多酚氧化酶的实验实验原理：多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类。在苹果原理：多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类。在苹果中，酶促褐变主要是因多酚氧化酶氧化内源的酚类物质生成邻醌，中，酶促褐变主要是因多酚氧化酶氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合或邻醌与蛋白质，氨基酸等作用生成高分子络合物邻醌再相互聚合或邻醌与蛋白质，氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗，严重影响制品而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗，严重影响制品的营养、风味及外观品质。的营养、风味及外观品质。PPO 的来源不同，它们的理化性质也的来源
2、不同，它们的理化性质也存在较大的差异，因而对同一物理或化学处理的敏感性不同。在生存在较大的差异，因而对同一物理或化学处理的敏感性不同。在生产实践中，根据原料的不同种类，来源和加工特点，合理选择产实践中，根据原料的不同种类，来源和加工特点，合理选择PPO 活性的抑制方法，对提高产品质量有重要作用。活性的抑制方法，对提高产品质量有重要作用。材料：无伤痕，无病害，品质良好的成熟苹果，品种为酸材料：无伤痕，无病害，品质良好的成熟苹果，品种为酸王，于王，于 44贮藏备用。贮藏备用。试剂：丙酮，磷酸盐缓冲溶液，邻苯二酚溶液，试剂：丙酮，磷酸盐缓冲溶液，邻苯二酚溶液，PVPP，Triton-100.Trit
3、on X-100(聚乙二醇辛基苯基醚聚乙二醇辛基苯基醚) 免疫细胞化学中，免疫细胞化学中，Triton X-100 常用浓度为常用浓度为 1%和和 0.3%，但通常是先配制成，但通常是先配制成 30%的的Triton X-100 储备液，临用时稀释至所需浓度。储备液，临用时稀释至所需浓度。30% Triton X-100 的配制：的配制： 试剂：试剂：Triton X-100 :28.2ml, 0.05mol/L PBS(pH6.8) 72.8ml配制方法：取配制方法：取 Triton X-100 及及 PBS 混合，置混合，置 3740水水浴中浴中 23h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀
4、释至所需浓度。，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。所需实验测出的数据及相关内容：所需实验测出的数据及相关内容：ph 对对 PPO 的影响及其的影响及其稳定性，最适反应温度及其它的热稳定性，对底物专一性的高低，稳定性，最适反应温度及其它的热稳定性，对底物专一性的高低，不同抑制剂对反应的抑制程度，不同抑制剂对反应的抑制程度，PPO 的酶促动力学参数。的酶促动力学参数。实验步骤设计实验步骤设计:(1)苹果洗净后在苹果洗净后在 4保温，再去皮后取果肉保温，再去皮后取果肉 200g，立即加入，立即加入冷冻丙酮冷冻丙酮 500ml,用高速组织捣碎机匀浆用高速组织捣碎机匀浆 2min；用布氏漏
5、斗；用布氏漏斗抽滤，滤饼用抽滤，滤饼用 200ml 冷冻丙酮再次提取抽滤，白色粉末在冷冻丙酮再次提取抽滤，白色粉末在蒸发皿中，在室温下干燥，即得蒸发皿中，在室温下干燥，即得 PPO 丙酮粉。丙酮粉。(2) 称取丙酮粉称取丙酮粉 0.5g,溶于溶于 250ml 0.05mol/L.ph6.8 的预冷磷酸的预冷磷酸盐缓冲液溶液，用磁力搅拌器搅拌盐缓冲液溶液，用磁力搅拌器搅拌 20min,5000r/min 离心离心10min,上清液过滤，即得苹果上清液过滤，即得苹果 PPO 粗酶液。粗酶液。选取方法选取方法：称取称取 100g 苹果果肉加入含苹果果肉加入含 1%PVP 的的0.2mol/L，pH6
6、.8 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(一一 5C，250ml)，然，然后用后用匀浆机打碎匀浆机打碎，再，再 l0000r/min 转速下捣碎转速下捣碎 3min，将糊状的苹果混合物用将糊状的苹果混合物用 FL 一一 20 型型冷冻离心机冷冻离心机，在，在0C，60000r/min 条件下离心条件下离心 15min，将清液和沉淀，将清液和沉淀分离，沉淀中再加入含分离，沉淀中再加入含 1%PVP 的的 0.2mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(一一 5C，250ml)，然后再与第一次捣碎，然后再与第一次捣碎相同的条件下捣碎相同的条件下捣碎 3min，再冷冻离心，再冷冻离心(条件同第一次条件同
7、第一次);所所得的沉淀排除，而所得的清液与第一次得到的清液混得的沉淀排除，而所得的清液与第一次得到的清液混合合(约为约为 500ml)。即粗酶液。即粗酶液。在混合清液中加入已在一在混合清液中加入已在一 18C 下冷却的丙酮下冷却的丙酮(一一15C，1000ml);丙酮要慢慢地加入，一边加入，一边丙酮要慢慢地加入，一边加入，一边慢慢地搅拌，加入完毕保持慢慢地搅拌，加入完毕保持 15min，然后冷冻离心，然后冷冻离心(条件同上条件同上);所得的清液进行丙酮回收，而所得的沉淀所得的清液进行丙酮回收，而所得的沉淀1000ml，一，一 5C 的的含含 1%TWEEN80 的的0.2mol/L，pH7.0
8、 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液，捣碎，捣碎 5，然后用磁，然后用磁力搅拌机力搅拌机 3C 下搅拌下搅拌 lh，最后进行冷冻离心，最后进行冷冻离心(条件同条件同上上)，所得的沉淀排除，而所得的清液即为多酚氧化，所得的沉淀排除，而所得的清液即为多酚氧化酶液，称酶液，称 PPO，其量约为，其量约为 1000ml.（成功提取）（成功提取）1， PPO 活性的测定活性的测定 取取 0.05mol 磷酸盐缓冲溶液磷酸盐缓冲溶液 1cm 比色比色皿中，加入皿中，加入 0.1M 邻苯二酚溶液邻苯二酚溶液 1ml,PPO 粗酶液粗酶液 0.5ml,混匀后在混匀后在 400mm 处比色，酶液加入后开始计时，每处比色，
9、酶液加入后开始计时，每30s 记录一次记录一次 OD 随时间的变化值，以最初直线段的斜随时间的变化值，以最初直线段的斜率率(D/t(D/t)计算酶活力，一个酶活力单位定义为：在测计算酶活力，一个酶活力单位定义为：在测定条件下，每分钟引起吸光度改变定条件下，每分钟引起吸光度改变 0.01 所需的酶量。所需的酶量。2， ph 对对 PPO 活性及稳定性的影响活性及稳定性的影响 配制配制 0.05M 醋酸钠缓醋酸钠缓冲液冲液(ph 3.5/5.6),0.05M 磷酸盐磷酸盐(KH2PO4NAOH)缓冲缓冲溶液（溶液（ph 5.8/8.0）在）在 1cm 比色皿中，加入食盐所设定比色皿中，加入食盐所设
10、定的缓冲溶液的缓冲溶液 1.5ml,0.1M 邻苯二酚溶液邻苯二酚溶液 1ml,PPO 粗酶液粗酶液0.5ml,混匀，在室温下测定混匀，在室温下测定 PPO 的活性。的活性。采用常规方法，在不同温度（范围采用常规方法，在不同温度（范围 10600，间隔为，间隔为 22，phph 为为 6.26.2）和不同）和不同 ph(ph(范围范围 3.03.09.0，间隔为，间隔为 0.2，温度，温度28)条件下测定条件下测定 PPO 活性（最大活性管为活性（最大活性管为 100 0相对活相对活性）性） 。稳定性的影响：分别吸取稳定性的影响：分别吸取 0.2ml 酶液，加在酶液，加在 0.4ml 不同不同
11、ph 的缓冲液中于的缓冲液中于 300保温保温 3030 分钟，然后将此保温的分钟，然后将此保温的PPOPPO 酶液与酶液与 2.4ml0.05mol/L2.4ml0.05mol/L 的邻苯二酚溶液（的邻苯二酚溶液（ph5.0ph5.0）于于 3030反应，测定反应，测定 PPOPPO 的残留活力。的残留活力。3， 温度对温度对 PPO 活性的影响及其热稳定性的影响活性的影响及其热稳定性的影响 在在 1cm 比色皿中，加比色皿中，加入入 0.05M 磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（ph6.6）1.5ml,0.1M 邻苯二酚溶液邻苯二酚溶液 1ml,在某在某一温度（一温度（20/50）保温）保温 5
12、min,加入相同温度下保温加入相同温度下保温 5min 粗酶液粗酶液0.5ml，迅速测定，迅速测定 PPO 的活性。的活性。热稳定性热稳定性 PPO 粗酶液在粗酶液在 100 水浴处理一定时间后立水浴处理一定时间后立即置于水浴中，然后再反应体系即置于水浴中，然后再反应体系 Ph6.0 室温下测定室温下测定 PPO的活性。的活性。4， 抑制剂对抑制剂对 PPO 活性的影响活性的影响 用用 0.2mol/L 磷酸盐缓冲溶磷酸盐缓冲溶液（液（ph6.0） ，配制不同浓度的黄酮化合物和抗坏血酸抑，配制不同浓度的黄酮化合物和抗坏血酸抑制剂溶液，在反应体系制剂溶液，在反应体系 ph6.0，室温下测定，室温
13、下测定 PPO 的活性。的活性。第一次实验失败原因：第一次实验失败原因： 1，邻苯二酚已经被氧化，所以测出的实邻苯二酚已经被氧化，所以测出的实 验数据不正确；验数据不正确； 2，对紫外可见分光光度仪的应用不熟练；对紫外可见分光光度仪的应用不熟练；3，在实验过程中在实验过程中 Ph 的调节不是非常正的调节不是非常正 确，应该有较大的误差；确，应该有较大的误差； 4，在溶液的配制中，存在着某些不确定在溶液的配制中，存在着某些不确定 因素，因而对实验造成的误差；因素，因而对实验造成的误差； 5，在制取出在制取出 PPO 后，有较长时间没有进后，有较长时间没有进 行处理，所以存在较大误差；行处理，所以
14、存在较大误差； 6，在研磨时温度没有控制好，造成酶的在研磨时温度没有控制好，造成酶的 失活可能性较大；失活可能性较大； 7，澳洲青苹，富士，红星，金帅，澳洲青苹，富士，红星，金帅， 8，如何测酶活力？在紫外可见分光光度如何测酶活力？在紫外可见分光光度仪上怎样辨别？吸光度和酶活力有什仪上怎样辨别？吸光度和酶活力有什 么关系？该如何去对应？在最大吸收么关系？该如何去对应？在最大吸收 峰处（首先如何测定较为准确的最大峰处（首先如何测定较为准确的最大 吸收峰）怎样测定酶活力？相对酶活吸收峰）怎样测定酶活力？相对酶活 力力? 9，对对 PVPP 的配制，要找出确定的值，的配制，要找出确定的值， 因不考虑
15、其对实验的影响因素，所以因不考虑其对实验的影响因素，所以 不做详细的实验，只加进去适量就可不做详细的实验，只加进去适量就可 10， 峰值高度和酶活力呈正相关。峰值高度和酶活力呈正相关。 11， 以吸光度为竖坐标，不用一酶活力以吸光度为竖坐标，不用一酶活力 为竖坐标，进行比较，因其与酶活力为竖坐标，进行比较，因其与酶活力 呈正相关。呈正相关。 12， PPO 活性测定时，底物邻苯二酚与活性测定时，底物邻苯二酚与 PPO 酶的用量之间的比例？酶的用量之间的比例？ 13， 在进行单因素实验时，试验因素的在进行单因素实验时，试验因素的 机动性如何安排？间隔为多少？温度，机动性如何安排？间隔为多少？温度， Ph,以多大为间隔，需要多少组数据可以多大为间隔，需要多少组数据可 以完成实验安排？以完成实验安排？ 14， 酶的比活力如何计算，如何对应紫酶的比活力如何计算，如何对应紫 外可见分光光度仪上的吸光度？外可见分光光度仪上的吸光度？ 15， 如何用酶的比活力做竖坐标，来绘如何用酶的比活力做竖坐标，来绘 制曲线？制曲线？16， 对照组如何控制对照组如何控制?以什么为底物？以以什么为底物？以 什么为参照？什么为参照？ 17， 各种溶液的浓度如何控制？各种溶液的浓度如何控制？ 18， 在在 410，412，420 处的最大吸收峰处的最大吸收峰 是如何出现的？是如何出现的？19，
