行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告 石斑魚神經壞死病毒 DNA 疫苗之開發 石斑魚神經壞死病毒 DNA 疫苗之開發 計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC93-2313-B-002-057- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學漁業科學研究所 計畫主持人： 陳秀男 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢 中 華 民 國 94 年 10 月 31 日1行政院國家科學委員會補助專題研究計畫行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 ■ 成 果 報 告■ 成 果 報 告 □期中進度報告□期中進度報告 石斑魚神經壞死病毒 D N A 疫苗之開發 計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫 計畫編號：NSC93－2313－B－002－057 執行期間：93 年 8 月 1 日至 94 年 7 月 31 日 計畫主持人：陳秀男 教授 共同主持人： 計畫參與人員： 成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告 執行單位：臺灣大學漁業科學研究所 中 華 民 國 94 年 10 月 31 日 2中英文摘要 計畫中文摘要：計畫中文摘要： 本計畫針對感染石斑魚的神經壞死病毒(Nervous Necrosis Virus ； NNV) ， 以市售的RNA 抽取套組(Trizol)，抽取其 RNA，進而利用針對病毒 RNA2 的專一性引子，以 RT-PCR 的方 式增殖病毒蛋白質鞘的基因片段，再與含真核生物啟動子的表現質體(pTarget T mammalian Express vector)接合，將此質體轉形(Transform)至大腸桿菌中，培養後純化含有病毒鞘蛋白 基因的大腸桿菌質體，以此質體為疫苗轉移感染(Transfer)至石斑魚腦細胞株(GBC1)，以西 方雜交式判斷此細胞株是否產生神經壞死病毒的蛋白質鞘 ， 以體外的方式(In vitro)探討此疫 苗的效果。
實驗結果顯示：利用專一性引子 NNV-F 及 NNV-R 可有效的增殖病毒蛋白質鞘 片段基因，其產物約 1345bp，包含完整的增殖病毒蛋白質鞘基因，此段 DNA 經與質體結 合後轉形(Transform)至大腸桿菌中，純化的質體以 Lipofectin 及電穿透作用(Electroporation) 皆可有效的送入 GBC1 細胞株中，利用大鼠抗 NNV 抗體以西方雜交的方式，可確認細胞 產生病毒鞘蛋白約 42KDa，因此可應用至魚體實驗，進而利用此 DNA 疫苗處理石斑魚苗， 以防治 NNV 的感染 Abstract：： Nervous Necrosis Virus (NNV) has been demonstrated to be main causes for the cultured marine fish worldwide. In recent decade, Taiwan, cultured groupers have been found to be infected by NNV with a massive mortality especially for the horal fish. The present study attempts to develop the DNA vaccines for protect NNV infection in marine fish. It is successful to extract viral RNA and amplify a 1330 bp product using specific primers (NNV-F&R) against NNV RNA2 by RT-PCR. After gene cloning, the purified plasmid that contained viral capsid protein genome was used as DNA vaccine and transfected into GBC1 cell line by lipofectin or Electroporation. The protection efficacy of DNA vaccine is then evaluated using rat anti-NNV antibody by western blot hybridization method. It is verified that the transfected cell produce 42KDa protein is same as the molecular weight of NNV capsid protein. Therefore, it is hopeful that developed DNA vaccine may be beneficial to grouper aquaculture industry in Taiwan. 3一、前言 自 1994 年起，臺灣養殖的石斑魚受神經壞死病毒(Nervous Necrosis Virus ；NNV) 的感染，引起魚苗及仔稚魚的大量死亡。
罹患病毒性神經壞死症(Viral nervous necrosis disease , VNN diseases)的魚苗，會表現出不正常的游泳行為，如螺旋前進、翻滾式前進、 迴旋打轉等，部份魚苗的身體有側彎的情形，並伴隨著食慾不振的情況，虛弱的魚苗 先是浮於水面上，最後沉入池底死亡，死亡率可達百分之百從病魚的組織病理切片 的觀察發現腦、脊髓和視網膜均有組織壞死現象電子顯微鏡的觀察，可見病變的細 胞其細胞質有 25nm的病毒顆粒，目前的實驗結果顯示：此病毒可以垂直感染或水平感 染至其他魚體 目前研究已知神經壞死病毒屬於結病毒科(Nodaviridae)之一種，魚類的結病毒屬 (Fish nodavirus)，與昆蟲結病毒屬(Insect nodavirus)有所區分這個屬的病毒可分成 TPNNV，SJNNV，BFNNV及RGNNV四大類，每一大類的病毒蛋白質鞘核酸序列相似 度高達 90%以上NNV病毒大小約 20-34nm，型態介於圓形與二十面體之間，不具有 外套膜，核酸含有 2 段RNA，其中RNA1 可轉譯出分子量為 110kDa的蛋白質，此蛋白 質只有在成熟的病毒中會出現，推測其功能為RNA-dependent RNA polymerase﹔RNA2 可以轉譯出兩條分子量為 40kDa及 42kDa的鞘蛋白。
鞘蛋白上含有病毒的抗原決定基， 可以幫助宿主細胞辨識此病毒主要感染魚苗時期，經由水平感染或垂直感染，可造 成魚苗很高的死亡率，目前尚無有效的防治措施，因此藉由分子生物學的技術研發石 斑魚神經壞死病毒的DNA疫苗以防治NNV的感染應為一可行且迫不及待的方法 二、研究目的 本計畫擬利用生物技術的方法研發石斑魚神經壞死病毒的DNA疫苗 ， 先於體外(In vitro)的方式探討其效果，進而應用此 DNA 疫苗處理石斑魚苗，以探討其對於 NNV 的 免疫反應及防治成效，評估此疫苗將來運用於魚苗養殖場的效果與實用性 三、文獻探討 關於魚類的神經壞死病毒(Nervous Necrosis Virus；NNV)，最早於 1990 年日本養殖的鸚鵡魚(Oplegnathus fasciatus)體內發現(Yoshikoshi et al., 1990)，陸續在世界各地皆 有病例被報告，目前已知有超過 24 種魚類受到此病毒感染並傳出大量死亡的疫情 (Munday et al., 2002)以往的實驗大多偏重流行病學及組織病理學的研究(Arimoto et al., 1993；Le Breton et al., 1997)。
為避免病毒的傳播，可利用物理或化學處理來抑制病 毒的活性，結果顯示病毒在pH 3 及pH 10-12 時感染力會下降，病毒的感染力在 60℃處 理 1 小時後亦會顯著的下降，碘、氯(50 ppm)處理 10 分鐘，紫外線(1x105µW.sec/cm2) 及臭氧處理皆可使病毒的活性下降(Arimoto et al., 1996；Frerich et al.,1996)在利用病 毒的偵測方式來防治疫情的傳播，Nishizawa等人於 1994 年建立以RT-PCR的方法，增 殖病毒的鞘蛋白基因RNA2 來檢驗魚體是否受用NNV病毒所感染(Nishizawa et al., 1994)Chi et al. (1999)建立了石斑魚(Epinephelus coioides)的鰭細胞株(GF-1)，此細胞 株可連續繼代培養而且對GNNV的感受性高，細胞病變明顯，易於判讀病毒感染情形 (Chi et al., 1999)原位雜交法不僅可偵測NNV病毒，同時發現病毒不只在腦、視網膜 等組織，亦出現在鰓，骨骼肌，肝臟，幽門腺，小腸和心臟的血球等處(Chi et al., 2001； Comp et al., 1996)。
2000 年Valle等人發展出兩步驟RT-PCR加上nested PCR的方法可以4快速檢測魚體的血液、精子和卵巢是否有病原性(Valle et al., 2000)有關利用免疫方法 來檢測NNV病毒方面，Lai 等人在 2001 建立了石斑魚(Epinephelus awoara)的腦細胞株 (GB cell line)，此細胞株對病毒具有感受性(Lai et al., 2001)2002 年以融合瘤所生產的 鼠抗體片段基因轉殖到此腦細胞株，細胞內產生的蛋白質(抗體)可與NNV病毒產生中 和反應此單元抗體可產生被動免疫，但仍未有活體試驗結果(Lai et al., 2002)將NNV 病毒及病毒鞘蛋白被注射入兔子體內，會產生多元抗血清，在攻擊試驗時會對培養的 細胞產生保護的效果(Hegde et al., 2002) 目前魚類的病毒性疾病尚無治療的藥物可供使用，因此應用疫苗免疫為防治病毒 感染的一種可行方法，疫苗的種類可分為殺死疫苗、減毒疫苗、重組疫苗、次單元疫 苗及DNA疫苗、其中DNA疫苗有成本較殺死疫苗低，安全性較減毒疫苗高，同時可能 激發細胞性及體液性免疫，以往的實驗結果顯示：Lorenzen等人在 1998 年以鮭魚的 VHSV G-protein及N-protein作為DNA疫苗，接種後發現在活體血清中有抗體產生 (Lorenzen et al., 1998)。
2003 年Sommerset等人以比目魚的結病毒G-protein的核酸序列， 藉著質體轉殖到大腸桿菌中，培養後純化出DNA疫苗，施予後發現此疫苗顯著的降低 了攻擊試驗的死亡率(Sommerset et al., 2003)因此應用NNV病毒的DNA疫苗來防治臺 灣養殖石斑魚的病毒性神經壞死症實為可行且有效的方法 石斑魚是國內重要的養殖對象魚，具有很高的經濟價值，但是對於造成養殖業嚴 重損失的石斑魚神經壞死病毒，並未研發出有效的預防及治療措施，有效而製造方式 簡便的疫苗更顯得迫切而需要以病毒的鞘蛋白來刺激魚體產生專一性免疫應該是一 迫不及待及可行的辦法 參考文獻：參考文獻： Arimoto, M., Mori, K., Nakai, T., Moroga, K., and Furusuwa. I.(1993). Pathogenecity of the causative agent of viral nervous nercosis disease of striped jack, Pseudocarnax dentex(Block & Schneider). Journal of Fish Diseases. 16,461-469. Ari。