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1、第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂,冻干过程和储藏过程的变性机理冷冻干燥保护添加剂的分类糖/多元醇类保护剂聚合物类保护剂表面活性剂类、氨基酸类的保护剂,在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素（例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等）都会影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。大量的实验研究表明，除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物料可以直接冷冻干燥外；大多数的药品和生物制品，都需要添加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进行有效的冷冻干燥和贮藏。,5.1 冻干过程和储藏过程的变性机理1. 冷冻和干燥过程,在
2、生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。低温效应 生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现，在-10-40之间，其活性显著降低，而继续降温到在-192，活性几乎没有变化。,冻结效应（包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化以及相分离等 ） （1）在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80%。当溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。 （2）在生物制品溶液在冻结过程中也会产生大量的冰-水界面
3、。其中活性组分分子，如蛋白质，可能会被吸附到界面上，从而可能破坏蛋白质的天然褶皱结构，最终导致蛋白质变性。 （3）在有些生物制品溶液的冻结过程中，溶液的pH值也会发生变化。如在添加有pH值为7的磷酸盐缓冲液（NaH2PO4和Na2HPO4的摩尔比为0.72）的蛋白质溶液冻结过程中，由于NaH2PO4的溶解度远远大于Na2HPO4，当溶液达到三相共晶点时，它们之间的摩尔比为57，最终导致了pH值的很大改变。蛋白质发生物理聚集和化学变性。,脱水效应（1）水溶液中蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附着一单层水，这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲，参与完全水合作用的
4、水含量为0.3-0.35g（水）/g（蛋白质）。而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10%，因此，必定有一部分结合水在干燥过程中被除去。（2）结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用，从而使蛋白质发生聚集 。,2. 储藏过程,蛋白质凝聚：是冻干生物制品活性组分在贮藏过程中发生变性的主要因素之一。导致蛋白质凝集可能是物理（非共价）相互作用，也可能是蛋白质发生化学凝集（共价）。 脱酰胺作用：也是蛋白质发生变性的主要途径之一。天
5、冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白质中易于发生脱酰胺作用的两种氨基酸。非酶褐变：也称作Maillard反应。它使得还原性糖（如葡萄糖）与蛋白质中的赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水络合物。 氧化反应：蛋白质中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，组氨酸His，色氨酸Trp和酪氨酸Tyr残基的侧链是发生氧化反应的可能位置。 水解作用: 虽然冻干的蛋白质中含有极少量的水分，但在贮藏过程中仍然会发生水解作用。,如前所述，生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过程，会产生低温、冻结和脱水等多种效应；即使成功完成冷冻干燥过程后，在长期保存过程中也很难保证冻干生物制品活性组分的稳定性。为
6、了防止生物制品在冷冻干燥和贮藏过程中活性组分的变性，研究者们研究和探索了大量有效的保护添加剂。,5.2 冷冻干燥保护添加剂的分类,按分子量分类 低分子量化合物：又可以分为酸性物质、中性物质和碱性物质。酸性物质主要为谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸等；中性物质主要为葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山梨醇D、L-苏氨酸、肌醇、木糖醇等；碱性物质主要为精氨酸和组氨酸等。高分子化合物：主要如白蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、糊精、肉汁、果胶、阿拉伯胶、羟甲基纤维素、藻类等以及天然混合物如脱脂牛奶、血清等。一般认为，低分子化合物在冻干过程中直接发挥作用；而高分子化合物则是促进低分子化合物的保护
7、作用。因此，制备保护剂配方时，一般多将低、高分子化合物配合使用。,按保护剂功能和性质分类 冻干保护剂（lyoprotectant）：在冻结和干燥过程中，可以防止活性组分发生变性的物质，如甘油、二甲亚砜（DMSO）、海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等；填充剂（bulking agent，bulking compound）：能防止有效组分随水蒸气一起升华逸散，并使有效组分成形的物质，如甘露醇、乳糖、明胶等；抗氧化剂（antioxidant）：用作防止生物制品在冷冻干燥过程以及贮藏过程中发生氧化变质的物质，如维生素D、维生素E、蛋白质水解物、硫代硫酸钠等；酸碱调整剂（buffer agent,
8、 PH modifier ）：在冷冻干燥过程和贮藏过程中，能将生物制品的pH值调整到活性物质的最稳定区域的物质，如磷酸、山梨醇、EDTA（乙二胺四醋酸二纳）、氨基酸等。,按物质的种类分类糖/多元醇类(sugars/polyols)、聚合物类(polymers)、表面活性剂类(surfactants)、 氨基酸类(amino acids)盐类(salts),在冷冻干燥配方中，除了活性组分和溶剂以外，还要使用多种添加剂。这些添加剂，有的被称为保护剂,有的被称为添加剂，而又有的被称为赋形剂（excipient），至今没有统一的叫法。赋形剂一词来源于药剂学，原来是指构成药物或抗原的无活性物质辅料 (如
9、阿拉伯胶、糖浆、淀粉)，特别是指在药物混合物中有大量液体情况下，为使混合物有较高的粘性，以便制备丸剂或片剂而加入的物质。而后来，赋形剂的名称被扩大了。根据文献资料统计，“赋形剂”一词在冷冻干燥配方中用得比较多。在生物制品的冷冻干燥配方中，有些赋形剂只能起到某一特定的作用；而有些赋形剂可以同时起到几方面的作用。如PVP既可用作低温保护剂，同时也可以用作填充剂。对保护剂在配方中具体起什么作用，有时很难严格区分开来。即使是同一种物质，在不同的冻干品也可能表现出不同的作用。,5.3 糖/多元醇类保护剂1. 糖和多元醇的定义,糖的主要组成元素是碳、氢、氧；而且其中氢和氧的比例总是2 ：1，恰好与水中氢和
10、氧的比例相同，所以，糖类也被称为碳水化合物（carbohydrate）。糖类一般可分为单糖、低聚糖和多糖三类。单糖是糖类中不能再水解的化合物，是最小分子的糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖等；低聚糖指能被水解成2-10个单糖分子的糖，主要有蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖等；多糖指能被水解成更多的单糖和低聚糖的糖，主要有淀粉、纤维素、果胶等。含有两个或两个以上羟基的醇统称为多元醇，又称糖醇（sugar alcohol）。在生物制品的低温冻结、解冻、冷冻干燥以及保存过程中，使用较多的是多元醇包括丙三醇（甘油）、山梨醇和甘露醇。由于糖和多元醇的官能团都是羟基，所以，它们用作低温保护剂和冷冻干燥保护
11、剂时，具有一定的共性。,2.单糖,从理论上讲，在生物制品的冷冻干燥过程中，如果糖类与生物制品活性组分的分子形成氢键而替代了原有水的位置，那么，它对这些生物制品就能够提供保护作用。实验证明，单糖（如葡萄糖、半乳糖）对蛋白质的冷冻干燥过程不能起到保护作用，这是因为单糖在冻结过程中只能提供非常微弱的稳定作用，使得蛋白质在脱水干燥前就发生了不可逆变性。而相同浓度的海藻糖在冻结过程和脱水过程中却都能提供有效的保护作用。目前的生物制品的冷冻干燥配方中，一般不单独使用单糖作为保护剂，而是经常和其它赋形剂联用。,3.低聚糖,在许多生物制品的冷冻干燥过程中，常常采用低聚糖，尤其是二糖作为保护剂，这是因为二糖既能
12、在冻结过程中起到低温保护剂的功能；又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用。二糖又分为还原性二糖和非还原性二糖，其中还原性二糖包括乳糖（lactose）、麦芽糖（maltose）等，非还原性二糖包括海藻糖（trehalose）和蔗糖（sucrose）等。就冷冻干燥过程而言，无论还原性二糖还是非还原性二糖都具有很好的保护效果，但在生物制品冷冻干燥后的贮藏过程中，由于还原性二糖的存在会使得冻干品发生Maillard反应（蛋白质褐变反应），最终导致冻干品发生变质。所以，在食品、药品以及生物体的冷冻干燥配方中，蔗糖和海藻糖是最常用的两种保护剂。,海藻糖的特异性,海藻糖是一种天然糖类, 是由特殊双糖分子
13、构成的非还原性糖，非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。,4.多元醇,甘露醇为白色结晶粉末，无臭、味甜；在水中易溶，在乙醇、乙醚中几乎不溶；熔点166-170，沸点290-295；在无菌溶液中较稳定，不易被空气氧化。在生物制品的冷冻干燥过程中，甘露醇一般用作填充剂，这是因为在慢速冻结时会结晶，从而为活性组分提供支撑结构；同时甘露醇也不会与活性组分发生反应。山梨醇是甘露醇的同分异构体，但其溶解度比甘露醇大，在常温下呈粘稠状透明液体，有旋光性；略有甜味，具有吸湿性，能溶解多种金属，高温下不稳
14、定。在冷冻干燥配方中，山梨醇一般用作填充剂。丙三醇又叫甘油，为无色透明的粘稠状液体，无臭而有甜味，熔点17.9，沸点290；吸水性强，能从空气中吸取水分；可以以任意比例与水、乙醇相混合，微溶于乙醚，不溶于苯、氯仿、四氯化碳和二硫化碳等有机溶剂，不溶于油脂。在冷冻干燥配方中，一般用作低温保护剂。,5.糖/多元醇的浓度对保护效果的影响,糖/多元醇对生物制品冷冻干燥过程的保护效果与其添加的浓度直接相关。当糖/多元醇浓度提高到一定程度时，对蛋白质的稳定作用能力可能达到了极限，过高的浓度甚至会使得冷冻干燥过程中蛋白质发生变性。,海藻糖初始浓度对磷酸果糖激酶（PFK）的冻干保护效果的影响,5.4 聚合物类
15、保护剂1.聚合物的定义,聚合物是指由简单的小分子(称为单体)，经过聚合反应，所形成的巨大分子。其分子量通常相当大，可能含数千到数十万个原子。有的聚合物形成链状,有的形成网状。聚合物具有能提高生物制品混合溶液的玻璃化转变温度等有利因素，因而在有些生物制品的配方中常常加入多种聚合物类保护剂。 聚合物类保护剂一般同时起着低温保护剂和脱水保护剂的作用。其中，最典型的的聚合物类保护剂有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、牛血清（BSA）、右旋糖苷（dextran）、聚乙二醇（PEG）等。,2.常用聚合物类保护剂,在一般情况下，在生物制品冷冻干燥配方中添加的聚合物具有以下的性质：聚合物在冻结过程中优先析出；具有一定
16、的表面活性；在蛋白质分子之间产生位阻（steric hindrance）作用；提高溶液黏度；显著提高玻璃化转变温度；抑制小分子赋形剂（如蔗糖）的结晶；抑制溶液pH的降低。,聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 常被用作澄清剂、色素稳定剂和胶体稳定剂。PVP对生物材料的低温保存，和冷冻干燥，都是很好的保护剂。同时它在生物制品的脱水干燥过程中又是很好的填充剂，为生物制品提供很强的支撑作用。 牛血清白蛋白（BSA）冷冻干燥粉末，常为白色或类白色；溶于水，其水溶液加热至60-70时蛋白会凝固沉淀。牛血清在很低的浓度下就能起到很好的保护效果，其保护作用原理与PVP一样。,右旋糖酐右旋糖苷是若干葡萄糖分子脱水的聚合产物，又叫葡聚糖。其分子量各不相同，相对分子量50000-90000为中分子（如右旋糖苷70），25000-50000为低分子（如右旋糖苷40），10000-25000为小分子，10000为微分子。抑制冰晶的长大，提供冷冻稳定性。右旋糖苷常被用作许多生物制品冷冻干燥的低温保护剂。 聚乙二醇（PEG）乙二醇可与环氧乙烷作用生成聚乙二醇，聚乙二醇工业上用途很广，可用作乳化剂、软化剂、表面活化剂等。PEG在生物材料的低温保存和冷冻干燥过程中也是很有效的低温保护剂，其保护效果与PEG的分子量有关。在一定程度上，它的低温保护能力远远大于其它低分子化合物（如蔗糖）。,
