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1、2014 级 五（2）许馨1引物：引物：是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条 DNA 模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条 DNA 模板链互补。Ct 值：值：是 PCR 扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数基因诊断：基因诊断：应用分子生物学技术,从 DNA/RNA 水平检测分析致病基因的存在,变异和表达状态从而对疾病作出诊断的技术RFLP：利用特定限制性识别位点进行基因分析的方法基因诊断常用的技术有哪些？基因诊断常用的技术有哪些？1.核酸分子杂交技术（hybridization） 2.等位基因特异寡核苷酸探针(allele spec
2、ific oligonucleotide, ASO) 3.DNA 限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析 4.PCR-PCR/单链构象多态性分析（PCR-Single-strand conformation polymorphism，PCR- SSCP） 5.DNA 测序（DNA sequence） .6DNA 芯片技术（DNA chip）基因治疗：基因治疗：将外源性正常基因导入到病变细胞或体细胞中，以置换或增补缺陷基因的功能，从而达到治疗遗传性疾病或获得性疾病的目的。基因治疗的策略有哪些基因治疗的策略有哪些?一、针
3、对致病基因而言： （1）基因修正（gene correction）对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能； （2）基因替代（gene replacement）用正常基因在原位替换致病基因，使细胞 DNA 完全恢复正常状态； （3）基因增强（gene augmentation）将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因 的功能 ，但致病基因未去除； （4）基因表达调节（modulation ）指将特定的反义核酸、RNA 干扰或核酶等技术抑制目的基因表达从而消除致病 基因的作用。 二、针对非致病基因而言： （1）自杀基因这种基因导入受体细胞后可产生一种酶
4、，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转 化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因” 。自杀基因导入肿瘤 细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。（2）免疫基因治疗将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF 等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵 抗力。 （3）耐药基因治疗2014 级 五（2）许馨2在肿瘤化疗过程中， 把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐 受更大剂量的化疗。 （4）More基因治疗的基本程序：基因治疗的基本程序：1. 目的基因的选择和获取 2. 目的基因与转运载体结合 3. 靶细胞的确认 4. 载体携带外源基因进入细胞 5. 外源基因的
5、整合 6. 外源基因的表达及检测 7. 治疗作用及稳定性、安全性评价克隆：克隆：一种无性繁殖技术。指一个亲本细胞产生成千上万个相同细胞组成的群体的过程。DNA 克隆：克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的 DNA）与载体 DNA 接合成一具有自我复制能力的 DNA 分 子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细 胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNA 分子，也称基因克隆或重组 DNA (recombinant DNA) 。 基因工程基因工程(genetic engineering)：有目的的通
6、过基因克隆技术，人为的操作改造基因，以改变生物的遗传性状的系列过程。基因克隆的技术路线：基因克隆的技术路线：1.分：分离制备目的 DNA 片段和载体 2.切：目的 DNA 与载体的剪切 3.接：目的 DNA 与载体的连接 4.转：重组 DNA 分子转化宿主细胞 5.筛：筛选阳性克隆，大量扩增基因克隆的基本原理：基因克隆的基本原理：1.目的基因的获取 2.载体的选择和构建 3.外源基因与载体的连接 4.DNA 导入受体菌 5.重组体的筛选 6.克隆基因的表达限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（限制酶）：限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别 DNA 的特
7、异序列, 并在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类内切酶。目的基因的分离：目的基因的分离：2014 级 五（2）许馨31、直接从染色体 DNA 中分离 2、人工合成 3、通过 mRNA 反转录合成 cDNA 4、从基因组 DNA 文库获取目的基因 5、从 cDNA 文库获取目的基因 6、PCR 扩增目的基因 7、索取载体：载体：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类 DNA 分子。质粒：质粒：是存在于细菌染色体外的小型环状双链 DNA 分子。大小约为数千碱基对。常有1-3 个抗药性基因，以利于筛选。质粒的特性：质粒的特性： 存在于细菌等细胞质中 双链环状 DNA 分子 大约 310
8、 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数，并表达其遗传信息转化转化（transformation ）：质粒或以其为载体的重组子导入细菌并得到表达的过程。转染转染（transfection ）：重组噬菌体或病毒导入宿主细胞的过程。转导转导（transduction ）：重组 DNA 经过外壳蛋白包装后转入宿主细胞的过程。基因：基因：生物体内有功能的核酸片段，是遗传信息储存的物质基础，决定个体/细胞的表型。基因表达：基因表达：基因经过转录或/和翻译过程，产生具有特定生物学功能的产物的过程。真核基因表达调控特点真核基因表达调控特点（一）活性染色体结构变化 （二）正性调
9、节占主导 （三）转录与翻译分隔进行 （四）转录后修饰、加工反式作用因子反式作用因子 (trans-acting factor)：直接或间接识别或结合顺式作用元件，参与靶基因转录效率调控的一组蛋白质。基因表达调控相关技术基因表达调控相关技术:1.电泳迁移率阻滞实验 （EMSA）2014 级 五（2）许馨42.报告基因分析 3.Dnase I 足迹法 4.甲基化干扰足迹法 5.Run-on 分析 6.染色质免疫共沉淀（CHIP）报告基因报告基因（reporter gene）: 又称选择标记基因，编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物很容易被鉴定。报告基因的标准：报告基因的标准：1.已被克隆和全
10、序列已测定 2.表达产物在受体细胞中不存在 3.表达产物可进行快速的定量测定 4.稳定、可靠报告基因分析的基本流程：报告基因分析的基本流程：1.重组载体的构建 2.细胞的培养（原核、真核） 3.导入细胞（转化、转染） 4.细胞提取物的制备 5.CAT 活性测定染色质免疫共沉淀（染色质免疫共沉淀（ChIP）:是基于体内分析发展起来的研究体内 DNA 和蛋白质相互作用的一种新方法，也称结合位点分析法。可用来研究：可用来研究：1.体内反式作用因子与顺式作用元件的相互作用2.RNA 聚合酶与 DNA 的相互作用3.一些外源性的结合蛋白与 DNA 的相互作用4. 组蛋白修饰与基因表达的关系核酸分子杂交：
11、核酸分子杂交：具有同源性的两条核酸单链在一定条件下,按碱基互补配对原则形成完整或局部互补双链的过程。核酸的一级结构：核酸的一级结构：核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。DNA 变性：变性：某些理化因素导致 DNA 双链互补碱基对之间的氢键发生断裂，DNA 双链解离为单链的过程。本质是双链间氢键的断裂。变性变性 DNA 分子理化性质的变化：分子理化性质的变化：（1）黏度降低 （2）密度增加 （3）沉降系数增加2014 级 五（2）许馨5（4）A260 吸光度值增加 （5）细菌转化能力消失DNA 复性复性: 当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链可重新配
12、对，恢复原来的双螺旋结构，这一现象称为 DNA 复性。退火退火(annealing): 热变性的 DNA 经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。Tm 的影响因素：的影响因素：DNA 分子的碱基组成 溶液的离子强度 pH 变性剂影响复性的因素：影响复性的因素：（1）核酸分子的浓度和长度 （2）温度 （3）离子强度：0.15-1.0M 盐溶液 （4）核酸分子的复杂性 （5）非特异性杂交反应印迹技术：印迹技术：待测的核酸分子转移到固相支持物上的过程。固相支持物应具备的条件：固相支持物应具备的条件：1.结合核酸的能力强（大于 10g/cm2) 2.不能干扰分子杂交的进行 3.
13、结合牢固，能耐受杂交和洗膜 4.非特异性吸附少（对蛋白等吸附少） 5.具有良好的机械性能和韧性两种印迹杂交法的不同点两种印迹杂交法的不同点:Northern 印迹Southern 印迹靶核酸RNADNA电泳变性电泳非变性电泳转膜转移前无须中和转移前须中和探针探针（probe）：用于检测的带标记的已知核酸片段。基因芯片基因芯片(gene chip)：将许多特定的 DNA 片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持2014 级 五（2）许馨6物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描， 通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量
14、的结果。该技术也被称为 DNA 微阵列(DNA microarray)。 基因芯片应用：基因芯片应用：1.分析基因表达时空特征 2.基因差异表达检测 3.发现新基因 4.大规模 DNA 测序 5.基因型、基因突变和多态性分析 6.疾病的诊断与治疗 7.药物的研发蛋白质蛋白质(protein): 是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能1.作为生物催化剂（酶） 2.代谢调节作用 3.免疫保护作用 4.物质的转运和存储 5.运动与支持作用 6.参与细胞间信息传递蛋白质的等电点蛋白质的
15、等电点: 当蛋白质溶液处于某一 pH 时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点。蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation): 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。蛋白质的复性蛋白质的复性(renaturation): 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。电泳电泳(elctrophoresis): 蛋白质在高于或低于其 pI 的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这
16、种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳。免疫沉淀免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP ）：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白 质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 Western blot: 又称免疫印迹(Immunoblot) ，它是根据抗原抗体的特异性结合检测样品中的某种蛋白，并能对蛋白进行定性和定量分析，具有高特异性和敏感性，是蛋白分析的 一种常规技术。Western Blot 操作步骤：操作步骤：2014 级 五（2）许馨71. 蛋白制备与定量 2. SDS-PAGE 3. 印迹（blot） 4. 封闭（block） 5. 一抗杂交 6. 二抗杂交 7. 显色
