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1、23No. 3目 录创 新文献参考Eppendorf RealMasterMix Probe 一种新颖的探针法荧光定量 PCR试剂Eppendorf 最新开发的针对荧光探针法定量 PCR 反应试剂，充分优化了 5-3 外切酶引发的荧光信号释放的最佳反应环境。本文选择在ABI 7000型和Bio-Rad iCycler iQ定量PCR仪上验证 Eppendorf的RealMaster Buffer的突出优势。通过用同一基因组模板的 96 次扩增重复试验、从基因组 DNA 中扩增单拷贝基因以及用于两个质粒模板组成的双重 PCR 试验，展示了该体系极佳的重复性、灵敏度及信噪比。Eppendorf P
2、erfectPure C-18 Tip 蛋白质纯化吸头：提高质谱分析质量的一种可逆式结合的蛋白或多肽的纯化和浓缩的高重复性方法PerfectPure C-18 Tips是一种将 C-18 层析介质固定于普通移液器微量吸头尖端的特殊吸头，通过吸液和放液的简单操作，可对超微量级（10-13 10 -15 mol）的蛋白水解产物进行脱盐、纯化和浓缩。 在质谱分析前，通过 Eppendorf PerfectPure C-18 Tip纯化和浓缩小量的蛋白，可有效地提高质谱分析的质量。Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 是蛋白质质谱分析的理想工具，它可用于质谱上样前小量蛋白质或多
3、肽的纯化和浓缩，能有效的提高质谱分析的质量。 PerfectPure C-18 Tip为分子量在15,000 道尔顿以下的蛋白质或多肽进行了特殊的优化处理，纯化蛋白的结合基质固定于吸头出口端，不同批次间的吸头都具有均一的反压特性，这对样品操作的重复性提供了有力的保证，而且对于高通量的纯化操作，如使用 8 道移液器或全自动移液操作工作站有着十分重要的意义。 PerfectPure C-18 Tip的纯化操作可采用三种洗脱方案，标准方法中使用已腈为洗脱剂，另外两种方案中需要额外使用正丙醇，它是一种疏水性更强的溶剂，可以进一步提高蛋白的回收率。本文中的一系列实验方法均为用于 Eppendorf Pe
4、rfectPure C-18 Tip 批间质检的方法。这些实验结果一方面能确保用户使用的是高质量的产品，同时这些实验结果也表明了 Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 在重复性、灵敏性和回收率方面的明显优势。为了验证吸头使用的重复性效果，我们测定了一定量气流通过吸头的反压大小。通过处理毫微微摩尔（femtomole）数量级的蛋白量，来检验吸头的灵敏性，测定最小的蛋白纯化量。最后通过回收- 酪蛋白（- casein） ，牛血清白蛋白（bovine serum albumin）和胎球蛋白（fetuin）消化后的主要多肽成分，来检测回收效率。摘要创 新Eppendorf Pe
5、rfectPure C-18 Tip 蛋白质纯化吸头： 提高质谱分析质量的一种可逆式结合的蛋白或 多肽的纯化和浓缩的高重复性方法图 1：7 种多肽片段分别以 1pmol 的量混合成多肽混合物标准样品（Bruker Daltonics Part # 20 61 95） ，总量为 10ng，溶解在 20l含500 mM 尿素和 25 mM 碳酸氢铵的缓冲液中。样品采用 Eppendorf PerfectPure C-18 蛋白纯化吸头进行脱盐、浓缩后，取三分之一样品上样于 MALDI 靶板上，同时与未经纯化的多肽溶液的 MALDI-TOF 分析结果比较，表明纯化处理后的多肽质谱分析结果质量有显著的
6、提高，信噪比高，肽峰清晰，极易识别。蛋白质组学是指对蛋白质组的分析、蛋白的表达，是对基因组学的功能性注释。二维电泳是主要分析平台之一（一维：电荷/PI；二维：分子量） （Bernard 等，未发表） ，可用于分析如疾病、刺激或分化引起的蛋白表达异常。这些异常表达的蛋白可以从电泳后的蛋白凝胶中分离、消化和抽提出来，然后进行质谱分析（MS） ，并结合生物信息数据库检索和分析。在做 MALDI 质谱分析前，残留在二维电泳消化产物中的盐和杂质必须去除，纯化后的蛋白产物才可以在矩阵中形成共结晶，避免产生离子抑制峰和去污剂的干扰峰。为了证实纯化步骤的重要性，图 1 比较了未经纯化和使用PerfectPur
7、e C-18 Tip纯化后的光谱分析结果。PerfectPure C-18 Tip 是一种方便、快捷的纯化工具，它不仅可以用于去除盐和杂质，同时还能浓缩微量多肽用以进行 MALDI 检测（见图 2） 。PerfectPure C-18 Tip 内含的树脂量可允许的最小洗脱体积为 0.5-1.0l。引言未经纯化的多肽质谱分析Eppendorf PerfectPure C-18 纯化的多肽质谱分析 9-123-5细胞电融合的原理和应用细胞电融合是单克隆抗体制备、哺乳动物克隆以及抗肿瘤疫苗制备等最新方法中的一个基本步骤。与化学融合相比，细胞电融合是一种更高效的方法。Eppendorf 的多功能电转仪
8、 Multiporator 现在将细胞电融合功能作为一个选配功能。该产品是与电融合技术的创立者U. Zimmermann教授合作开发的。适用于真核细胞和植物细胞的电融合，具有独一无二的直接放大反应体积的特性。 6-7实用技巧Perfectprep Plasmid 系列的质粒纯化试剂盒 有效回收超纯质粒 DNAEppendorf Perfectprep系列的质粒纯化试剂盒优化了传统的质粒纯化过程，采用改进的碱裂解法与用于结合质粒 DNA 的液态介质，既有效地分离了染色体 DNA 与质粒 DNA，又有效去除 RNA、蛋白质、多糖等多种杂质。充分满足您获得超纯质粒的迫切需要，与同类产品相比更有利于下
9、游转染等应用。8MasterTaq 聚合酶应用于腐殖质污染的 DNA 模板的PCR扩增反应在土壤或河床沉积物中采样用于提取总DNA时伴随提取到土壤中的腐殖质或其他的腐败物质，这些污染物会抑制 PCR 反应中 Taq 聚合酶的活性或是抑制限制性内切酶的活性。腐质酸和核酸具有相似的理化特性，因此很难完全去除。本文的实验和结果，说明了MasterTaq 聚合酶在扩增从沉船打捞物中提取的含腐质污染的 16SrDNA基因的PCR 反应中具有很好的适应性。13-14您在使用 Eppendorf PCR试剂时经常遇到的问题，答案就在这里！15Q & A未经纯化的多肽质谱分析Eppendorf Perfect
10、Pure C-18 纯化的多肽质谱分析 45No. 3创 新创 新Adjust the concentration of TFA to 0.1%1% (pH4)PRE-WETEQUILIBRATIONBINDWASHELUTEAspirate 10 l of Pre-Wet SolutionAspirate 10 l of Equilibration / Wash SolutionDiscard and repeatAspirate and dispense prepared sample 310 timesAspirate 10 l of Equilibration / Wash Solut
11、ionDiscard and repeatCarefully aspirate and expel the Elution Solution 35 times图 2：Eppendorf PerfectPure C-18 Tips 是一种快速便捷去除盐杂质和浓缩微量MALDI 分析的多肽的方法。可重复性的检验对 3 个不同批次的 32 个 Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 进行了气体流动压力测试，吸头的尾部连接到压力泵，吸头的前端连接在流量计上，以测量气体流速（L/min） 。这个测量方法模拟测量了吸头前端在装载了树脂后产生的反压大小。通过吸头的气体流速越大，反压越小
12、。这样就能更好保证实验操作的一致性和可重复性。不同批次的三组样品均采用的是同一种测量方法。灵敏度的检验在 Bruker Biflex III 线性模型分析下，经二次重复实验。已知组分的 7 种多肽混合物（Bruker Daltonics Part # 20 61 95） ，用下述缓冲液稀释：含 25 mM 碳酸氢铵，4%蚁酸， 0.1% 三氟乙酰酸， 500 mM 尿素，3 mM Tris，和0.120 mM 2- 巯基乙醇。 多肽混合液的终浓度分别为：50 mol/l，12.5mol/l 和3.125mol/l。20l多肽溶液采用 Eppendorf PerfectPure 标准操作方法脱盐
13、并浓缩至3l，取三分之一样品进行MALDI 分析。回收率的检验在 Bruker Biflex III 线性模型分析下，经二次重复实验。- 酪蛋白、牛血清白蛋白和胎球蛋白各 100ng，浓度5ng/l，在7.5M 尿素和 2 mM 2- 巯基乙醇溶液中热变性，经 Promega 测序级胰酶消化过夜，用 4% 蚁酸终止消化。20l 消化产物经 Eppendorf PerfectPure C-18 使用说明书中的 3 种直接洗脱方法进行纯化，浓缩至 3l，同类竞争品牌的吸头也按照其相应步骤纯化同一消化产物。材料和方法可重复性Eppendorf PerfectPure Tip 所测得的气流速度重复性好
14、，在不同吸头间与不同批次间的差异小（图 3） 。在这一测量体系中，Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 的性能优于其他品牌的同类产品，具有更高的、更一致的气体流速和更小的批间差异，使得 Eppendorf PerfectPure Tip 具有持久的低反压，使操作更可靠。这个优势有益于样品间的可重复性和高通量、自动化操作的应用。结果与讨论图3：Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 在气体流动性方面有良好的重复性，吸头个体与批间的差异非常小。吸头操作时的气体流动性的测试是通过压力泵连接吸头的末端，压力泵可提供定量的气流，吸头的出口端连接在流量计上，以
15、测定气体流速（升 / 分钟） 。这个方法模拟测量的吸头出口端在装载了结合基质后产生的反压大小。我们对 3 个不同批次的 Eppendorf PerfectPure C-18 Tip样品和同类竞争品牌的3个批次样品进行了气流压力测试。结果表明，PerfectPure C-18 Tip 的反压更均一，个体差异更小。灵敏性为了检测吸头纯化的灵敏度，我们设计了已知含量和分子量的标准蛋白消化产物（1000 3000 Daltons）的检测体系。Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 可以结合、浓缩和洗脱出 62.5毫微微摩尔的蛋白量（图 4） 。这样的灵敏度能够满足分析大概 3ng
16、、分子量为 50KD 的蛋白。同时也用 MS 以及更精密的仪器进行了检测，其灵敏度更高（结果未在本文中列出） 。图 4：Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 可以纯化起始样品量在微量级的蛋白样品。已知组分的 7 种多肽混合物（Bruker Daltonics Part # 20 61 95） ，用下述缓冲液稀释：含25 mM碳酸铵（ammonium bicarbonate） ，4% 蚁酸（formic acid） ，0.1%三氟乙酰酸（trifluoroacetic acid） ，500mM 尿素（urea） ，3mM Tris，和0.120mM 2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol） 。多肽混合液的终浓度分别为：50mol/l，12.5mol/l，和 3.125mol/l。20l 多肽溶液采用 Eppendorf PerfectPure 标准方案除盐，浓缩至 3l，其中取三分之一样品进行MALD
