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1、Y1 4 0 6 7 9 8中山大学博士学位论文周围神经功能束三维可视化系统开发的 技术路线前期研究AP r e l i m i n a r yR e s e a r c ho fT e c h n o l o g i c a lL i n eo nT h r e e D i m e n s i o n a lR e c o n s t r u c t i o nS y s t e mo fP e r i p h e r a lN e r v eF u n c t i o n a lF a s c i c u l a rG r o u p s专业名称：外科学申请人：戚剑导0 5 x l l ,
2、 J , 林教授答辩委员会主席：答辩委员会成员：2l、加1 仃7f ) 帖广州课题来源：国家自然科学基金资助项目3 0 5 7 1 9 1 3 ( 2 0 0 6 年度)中山大学饽士论文周嗣神经功能束三维可视化系统开发的技术路线前期研究中文摘要域更高水平的教学、科研和临床应用的研究平台和技术支撑，已经成为阻碍周围神经外科进一步发展的一个瓶颈问题亟待解决。目前，基于神经连续组织切片和A C h E 染色的周围神经功能束三维可视化研究尚处于初始阶段，由于周围神经内外部的信息难以抽取，至今全世界还没有完整的神经系统三维可视化模型。周围神经功能束三维可视化系统的开发研究作为一个需要医学与计算机科学互相
3、协作的跨学科课题，面临众多的技术难题，重建软件固然是最后的体现形式，但三维重建计算机编程需考虑的相关医学因素包括怎样才能获取达到目的又能为计算机所识别的二维图像，其图像制作的标准技术流程；在从二维向三维转化过程中会遇到哪些困难，怎样在符合医学规律又能达到目的的情况下去寻找计算机语言能接受的方法予以解决，现市售可用的一些普通三维重建软件在应用于神经可视化研究的过程中的可适性怎样，还存在哪些必须考虑而尚未考虑的因素，这些都是急待解决的问题。本研究针对这一需求，基于周围神经连续组织切片和A C h E 染色，拟对三维重建可视化周围神经功能束的前期技术流程、标准化图像获取及连续组织切片的图像配准和分割
4、等关键技术路线进行研究，并尝试市售三维重建软件重建的可适性，为今后计算机科学开发相关软件提供医学背景和技术要求，从而为进一步确立成熟标准的技术路线提供合理化建议。目的1 通过图像分析观察K a r n o v s k y R o o t s 铁氰化铜法乙酰胆碱酯酶2 4 h 内染色规律，确定可作为周围神经功能束三维重建切片染色识别功能束性质的标准孵育时间。2 通过对比3 O T 核磁共振、神经横断染色切片镜下显微摄影和神经横断染色切片扫描仪扫描获得的数字化神经断面二维图像的特点，并尝试不同的图像拼接软件对周围神经横断染色切片4 0 和1 0 0 倍光学显微镜下矩阵图像的拼接对比，以评价可用于神
5、经功能束三维重建获取二维全景图像的适合方法，选取实现高倍镜下获取神经切片二维全景图像最优的图像拼接软体，并确定合理的放大倍数。3 以胭窝段5 c m 腓总神经为研究对象，确立基于P h o t o s h o p 实现连续神经组织切片二维图像的配准和分割技术流程，通过A m i r a 三维重建软件观察腓总神经功能束三维重建的效果，验证该技术流程的可靠性，评价A m i r a 用于周围神经功能束三维重建的可适性，为今后计算机科学开发相关软件提供医学要求和技术中山大籼丈周围神经功能束三维可视化系统开发的技术路线前期研究中文摘要要求，从而为制定成熟标准的技术路线提供合理化建议。此外，通过对胭窝段
6、腓总神经的三维重建，观察其功能束的变化规律，为临床胭窝段腓总神经损伤的修复提供指导性建议。材料和方法1 新鲜成人截肢腓总神经标本，横断面连续冰冻切片，片厚1 0 啪，共切取5 6 张切片。随机分为7 组，每组8 张切片，其中1 6 组分别为1 h 组、2 h 组、4 h 组、8 h 组、1 2 h 组和2 4 h 组，第7 组为阴性对照组。K a r n o v s k y - - R o o t s 铁氰化铜法A C h E 组织化学孵育，在光学显微镜下观察不同染色时间下神经纤维成分染色特点，用I m a g e - - P r oP l u s6 0 图像分析软件对不同时间染色组图像进行图
7、像分析，分析指标为A C h E 反应阳性区域的面积、平均光密度和累积光密度。2 M R I O 经横断图像为1 名正常健康成年男性胭窝段腓总神经；神经横断切片为新鲜成人截肢胭窝段腓总神经及腕段正中神经，各切取1 0 张，共2 0 张切片，腓总神经切片5 张行H E 染色，5 张行A C h E 染色，正中神经切片5 张行H E 染色，5 张行A C h E 染色；神经横断染色切片图像分别采取显微镜下系列矩阵摄影和扫描仪扫描获取二维全景图像。对神经染色切片分别进行4 0 倍和1 0 0 倍镜下系列摄影图像，应用A u t o s i t c h 、P a n o r a m aM a k e
8、r 及P h o t o s t i t c h 等三种图像拼接软件进行图像拼接实现二维全景图像获取，对比软件优缺点及A C h E 染色神经切片4 0 倍和1 0 0 倍二维全景图像的特点。从是否含有神经功能束生理信息、神经束轮廓是否清晰等角度，对比分析3 O T 核磁共振、神经横断染色切片镜下显微摄影和神经横断染色切片扫描仪扫描获得的数字化神经断面二维图像的特点。3 基于P h o t o s h o p7 0 建立一套实现神经连续切片二维手工图像配准和分割的标准操作技术流程，以胭窝段5 c m P 排总神经为研究对象，基于连续组织冰冻切片矛I A C h E 组织化学染色，图像拼接获取1
9、 0 0 倍镜下二维全景图像，通过A m i r a 3 1进行腓总神经功能束三维重建；3 O TM R I 对1 名健康成年男性胭窝段进行横断成像，根据神经在M R I 上的成像特点，使用绘图板在M R I - “ 维图像中手工分割腓总神经，以及胫神经、胭动脉和骨的轮廓，应用A m i r a 3 1 进行腓总神经复合骨、胭动脉和胫神经的三维重建。通过两种解剖水平腓总神经三维重建的效果对比，分析周围神经功能束三维可视化研究技术路线的难题和对进一步研究的要求。结果1 孵育时间由l h 至2 4 h ，镜下观察，周围神经运动有髓纤维和交感神经无髓，。、咿中山大学博士论文周围神经功能束_ 三维可视
10、化系统开发的技术路线前期研究中文摘要纤维染色面积和强度呈递增趋势，8 h 一- 2 4 h 染色结果可明确鉴别神经束功能性质，以2 4 h 效果最佳，但2 4 h 染色结果存在过度染色：图像分析阳性区域面积8 h 2 4 h ，P ( s h - l 孙) 0 0 5 ；累积光密度8 h 2 4 h ，P ( 8 h 一12 h ) O 0 5 ，I O D ，8 h m # * 士t e 支月罔神经功能柬! 维W m 化系统开发的技术路线前期研究第一部分2 不同染色时问阳性染色效果的图像分析结果因染色1 h 时无髓纤维仅轻度着色，而运动有髓纤维几乎投有着色，故没有进行图像分析和统计分析。利用
11、1 P P 60 图像分析软件对其余5 个不同染色时段高倍视野( X 4 0 0 ) 下的阳性反应区域进行平均面积、平均光密度值、累计光密度值进行分析，所得数据见表1 1 ：上业L 一j b 凹盟E 韭L 一业一2 h9 7 59 3 1 88 42 2 7 803 4 8 100 0 2 23 7 54 0 9 03 43 3 2 8 4 h1 2 4 16 1 7 01 1 68 4 5 003 5 6 100 0 4 75 0 94 9 7 95 37 0 0 5 8 h1 3 9 95 0 7 01 1 55 6 5 903 5 2 800 0 2 45 5 8 7 9 75 07 3
12、 9 3 1 2 h1 9 8 78 5 3 31 4 98 3 8 603 6 1 700 0 2 88 4 62 3 4 27 26 3 2 6表1 - 1 ：不同染色时段阳性反应区域平均面积、平均光密度值、累计光密度值数据“臼图1 4 ：不同染色时段刚性反戍区域平均面积、平均光密度值、累计光密度值直方图由表1 - 1 和图1 - 4 中可以看出，不同染色时段阳性反应区域平均面积和累计光密度值随着染色时间的延长而呈增加趋势，而平均光密度值则无明显的变化规律，由2 h 至2 4 1 1 总体呈增高趋势，但却在染色1 2 h 时数值达到最高。将不同染色时段阳性反应区域平均面积、平均光密度值、累
13、计光密度值数据两两对比t 4 c s t 统计检验结果见表1 - 2 ：女L 一坠E 巫业一删L 一 2 h 唧口6 9p 0 。 p - o0 0 。9 唧蛳2唧1 2 8p = 0 1 4 9 邱0 0 0 3 脚1 9 0唧0 3 9 唧咄础O o O l 龇D 24 h础3 4 2 00 0 0 2 唧0 3 9 3- 5 4 1p - O3 1 9 叫6 *p _ 05 0 7p 目0 0 0 49 0 口0 38 hp 口0 3 唧0 0 惦r 00 1 9 衄8 7 8唧0 0 2D = n0 0 0 2表1 五：不同染色时段阳性反应区域平均面积、平均光密度值、累计光密度值数据两
14、两对比t - t 船t 统计检验结果_ _ I中山大籼文周围神经功能柬三维可视化系统开发的技术路线前期研究第一部分五个时段的阳性面积( A r e a ) 两两比较，P ( 扑- 4 h ) 0 0 5 ，P ( 4 h - S h ) 0 0 5 ，表明2 h 和4 h 和8 h 的阳性面积没有显著性差异；而其它的都有P O 0 5 ，结果表明不同染色时间下切片的平均光密度没有显著性差异。结合镜下的大体观察和8 h 1 2 h 问平均光密度存在显著性差异，而1 2 h 2 4 h 间平均光密度无显著性差异等结果来看，1 2 h 后的神经纤维染色强度已经比较满意，可用于不同性质神经束的准确鉴别
15、。五个时间段的累积光密度( I O D ) 的两两统计检验，除了P ( 4 h - S h ) O 0 5 ，其余都有P 1 2 h 8 h 2 h ，这说明了在一定时间范围内( 一般2 4 h ) ，染色时间越长染色反应越彻底。而4 h 和8 h 染色结果的面积，平均光密度和累积光密度的比较都有P O 0 5 ，表明4 h 和8 h 的染色效果没有显著性差异。讨论1 鉴别周围神经束运动和感觉性质的酶组织化学染色方法目自I f 己知的可用于鉴别周围神经束运动和感觉性质的酶组织化学染色方法主要有三种，分别是乙酰胆碱酯酶组化法、碳酸酐酶组化法和胆碱乙酰转移酶放射生化法。碳酸酐酶组化法由于孵育条件尚
16、未成熟，染色效果不稳定，目前仍处于实验阶段，且感觉有髓纤维轴索和运动有髓纤维的髓鞘均呈阳性反应，不利于今后利用计算机的自动识别：而胆碱乙酰转移酶放射生化法技术复杂，实验条件要求高且不经济。三者比较，A C h E 组化法最为简便稳定，重复性好，鉴别神经束性质可靠，目前在周围神经基础研究和临床应用研究中已经得到较为广泛的使用【6 l 0乙酰胆碱酯酶( A C h E ) 在神经节胞体合成，然后经轴索运送到突触前膜和突触后膜。A C h E 在周围神经中含量较高，尤其是在胆碱能神经。已知躯体运动神经，全部副交感神经和小部分交感神经节后纤维都属胆碱能神经。因此运动神经纤维一1 2 一， - 、桫中山犬掌博士论文周围神经功能束三维可视化系统开发的技术路线前期研究第一部分中A C h E 远高于感觉纤维。通过A C h E 组
