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1、微微 生生 物物 学学实验报告实验报告开课时间室：A 区文科楼 510 2012 年 11 月 29 日学院生物工程学院年级、专业、班10 级生工 01 班姓名吕亚慧成绩课程名称微生物学实验实验名称微生物的直接镜检记数法指导教师李苹教师评语教师签字： 年 月 日 实验目的：实验目的：1明确血细胞计数板计数的原理。2掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。实验原理实验原理1、显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。2、 用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血球计数板是一块特制的载
2、玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短槽隔成两半，每一边的平台上各自刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如下图。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格；另一种是一个大方格分成 16 个中方格，而每个中方格又分成 25 个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是 400 个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为 1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为 0.1mm，所以计数室的容积为 0.1mm3。计数时，通常数五个中方格的总菌数
3、，然后求得每个中方格的平均数，再乘上 25 或 16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成 1ml 菌液中的总菌数。实验器材实验器材器材：血球计数板(含特制的盖玻片)、显微镜、玻棒、吸水纸、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、擦镜纸、1mL 无菌吸管、无菌毛细管等。菌种：稀释 10 倍的酵母菌培养液，果酒发酵醪液、酿酒酵母实验方法实验方法一、酵母菌细胞数的测定1.放置 2 毫米显微千分尺放在显微镜载物台， 物镜取 40，测算每个视野的直径并计算面积 1 个视野的面积 = （直径 / 2 ）2 3.142.菌悬液制备：按无菌操作要求，用 1mL 无菌吸管自稀释 10 倍的酵母菌培养液试管中吸取菌
4、液 1mL 移人 9mL 无菌水中，充分混匀，即得稀释 100 倍的计数样品。原则以每个小格菌数为 5-10 个为宜来记数进行稀释。3.清洗计数板：将血球计数板及专用的厚盖玻片用药棉沾取 95酒精轻轻擦洗，然后用自来水冲洗，再让其自然晾干或吸水纸吸干。 4.镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。5.加样品：将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，从盖玻片的一端注入，使菌液沿二玻片间渗入，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液，勿使菌液流到盖玻片或两边平台上，多
5、余的菌液则用吸水纸吸去。6.显微镜计数：静置几分钟后，先置低倍镜下观察，找到中央平台上的小方格网后，转换高倍镜进行计数。计数时，如用 1625 规格的计数板，则取左上，右上，左下，右下四种格(共 100 个小格)的酵母菌数；如用 2516 规格的计数板，则除了取左上，右上，左下，右下四个中格外，还需加数中央的一个中格(共 80 个小格)的酵母菌。在分别求出 100 个小格或80 个小格的酵母菌平均菌数后，按下式计算：加样后静止 5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。如果是 25 个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中
6、央 l 个中方格的菌数（即 80 个小格）；2516 型血细胞计数板的计算公式：7.清洗血细胞计数板：使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。关键步骤及注意事项1.防止加样空气泡产生。2.调节显微镜光线的强弱适当。实验结果数据记录及分析实验结果数据记录及分析血球计数板直接计数法其优缺点：优点是清楚直观，将微生物圈在一个个的小格子里数自然要比没有格子数要方便很多，准确性也有所提高。缺点是受人为主观因素较大，每个人数同一个中格里的微生物都会数出不同的结果，因为有些
7、微生物是有芽孢的，有些芽孢还没有和母体分离，只是母体体积变大，导致有些人数是把它当两个数，有些人当作一个。实验结果的准确性受很多因素的影响，刚才上面说的缺点就是一条，除此之外，在将菌悬液滴入计数板前是否将其摇匀；数每个中格里的微生物所采用的方法，如你是如何数那些压线的微生物，这些都会影响最终你所数出的微生物数量。 所以我们在实验操作的时候需要规范严禁，以提高结果的准确性。在进行观察计数时，由于菌体在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到。所以观察时必须不断调节微调螺旋方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于小格的线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，这样做，即可减少误差。酵母菌的芽体细胞达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算，每个样品应重复计数 2-3 次(每次数值差数不应过大，否则应重测)再取其平均值。
