《β葡聚糖酶的定向进化及热稳定性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《β葡聚糖酶的定向进化及热稳定性研究（150页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浙江大学博士学位论文-葡聚糖酶的定向进化及热稳定性研究姓名：张秀艳申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：何国庆20060101浙江大学博士学位论文摘蔓遗传稳定性检验结果表明：E G s l 和E G s 2 突变株传代5 0 次后，质粒稳定性良好，重组表达的目的产物活性保持恒定，说明突变株的遗传稳定性良好。通过摇瓶发酵分析，突变株E G s 2 最佳生长条件为：装液量4 0 m l ，接种量1 5 ，初始p H 值为65 7 0 。在此条件下，菌体生长6 小时后进入稳定期。分别用I P l 、G 和乳糖作为诱导剂，对适于菌体生长和目的产物表达的条件进行优化，结果显示：I P T G 和乳糖
2、都可以作为重组工程菌的诱导剂i 乳糖的诱导效果稍好于I P T G 的诱导效果；I P T G 浓度对菌体生物量和目的产物表达量影响不大，而乳糖浓度对菌体生物量和目的产物表达量的影响较大。温度对目的产物在上清液中的积累影响较大，对菌体生物量的影响不大。合适的I P T G 诱导条件为：诱导时间，4 小时；诱导剂浓度，01 m m o l L ：诱导温度，3 4 。合适的乳糖诱导条件为：诱导时间，4 小时：诱导剂浓度，l O m m o l L ；诱导温度，3 2 。通过单冈素实验，筛选出能提高B 一葡聚糖酶热稳定性的保护剂，并设计正交实验优化复合保护剂组成。结果表明白蛋白，明胶和c a c l
3、 2 2 H 2 0 都能明显提高B 葡聚糖酶的稳定性；复合保护剂配方为：o 8 ( w ) 自蛋白，2 ( w v ) 明胶，1m m o l ，Lc a c l 2 2 H 2 0 。含保护剂的口葡聚糖酶的T m 值比不含保护剂的酶的T m 值高4 ，加保护剂和未加保护剂的酶液在3 62 下的热降解速度分别为O 0 3 9 8 和O 0 8 4 ，这说明保护剂对酶的热稳定性和储存稳定性都起到了较好的保护作用。利用加速实验估算了B 葡聚糖酶在不同温度下的储存寿命。选择的实验温度为2 8 ，3 6 2 ，4 5 。将盛有6 葡聚糖酶的样品瓶放入不同温度的水浴中，不同时问取样并测定B 葡聚糖酶活
4、性。实验数据的统计处理结果得出：B 葡聚糖酶在4 5 ，3 6 2 和2 8 活性损失l o 所需时间为1 3 6 d ，43 7 d 和2 0 0 9 d 。活性损失5 0 所需时间为8 5 d ，2 5 4 7 d ，1 0 4 9 d 。由寿命估算曲线估算出B 一葡聚糖酶在2 5 ，2 0 ，1 5 ，4 和O 时，活性损失1 0 需要的时间分别为3 0 7 d ，6 7 O d ，1 4 59 d ，22 1 年，41 4 年：活性损失5 0 所需时间为1 5 4 0d ，3 1 6 Od ，6 4 8d ，3 1 5 4d 。从加速实验的结果可以看出B 葡聚糖酶的稳定性可以满足储存的
5、需要。加速实验可以在较短时间内估算出B 葡聚糖酶的储存寿命。关键词：定向进化；易错P c R ：D N A 改组；热稳定性；B 一葡聚糖酶；高通量筛选；突变体库：发酵条件；保护剂；加速实验：储存稳定性X浙江大学博士学位论文A b s I r a c tA b s t r a c tp g l u c a 玎a s ei sa 1 1i m p o r t a n ti n d u s t r i a le n 纠m ea n di so f t e na d d e dt 0r e d u c en e g a t i v ee f 艳c to fp g I u c a ni nb r e w
6、 i n ga n df e e d s _ 1 l f fi n d u s t r i e s ，b u tt h es t u d yo nt h ep g l u c a n a s eb e g a nl a t ea n dt h et h e 丌r l o s t a b i l i 母o fp 9 1 u c a n a s ew a sp o o rw h e nc o m p a r e dw i t hf o r e i g ns t u d i e s T h ep o o rt h e n n o s t a b i l i t yo f p - g l u c a
7、n a s ed o e sn o ts a t i s 句t h et e m p e r a t l l r er e q u i r e m e n to f m a l t i n ga 1 1 df e e d s t t I f f p r e p a r a t i o n ，s oi ti ss i g n 墒c a l l tt oi m p r o v et h et h e 瑚o s 诅b 订时。邛一g l u c a n a s e T h j sp r o j e c ti sa i m e da tt h ef 0 1 l o w i n ga s p e c t
8、s ：M o I e c u I a rc l o n i n ga f l de x p r e s s i o no fp g l u c a n a s eg e n ei nE ；T h ed e V e l o p m e n to 仆i 曲- t h r o u 曲p u ts c r e e n i n gm e t h o df o rt h e r r n o s t a b I ep g l u c a n a s e ；E n h a n c i n gt h et h e 丌r l o s t a b 讯t yo fp t g l u c a T l a s eb yd
9、 i r e c t e de v o l u t i o na n ds c r e e n i n gw i 血廿1 ed e v e l o p e dm e l h o d ；c h e c k i n gt h eg e n e t j cs t a b i l i t yo fl h et h e r m o s t a b l em u t a n t s ；O p t i m i z i n gE h ef b n l l e n t a t j o nc o n d l t i o n so fm u t a n tE G s 2 ；S c r e e n j n ga n
10、do p t i m i z i n gt h ec o m p l e xp m t e c t i V ea g e n tf o rp - g l u c a n a S e ；E V a l u a t i n gt h es t o f a g 。p er i o do fp g l u c a n a s eb ya c c e l e r a I e ds t o r a g et e s t T h em a i nr e s u n sa r es h o w na Sf 0 I l o w i n g ：T h ee n d o - B 嘿l u c a n a S eg
11、e n ef r o m 口钟珊Ws 曲f f 船z J F l A 5w a sc I o n e dT h eo b t a i n e d8 4 9 b pD N A昀揶e n tw a si n s e r t e di m ot h ev e c t o rp E T 2 8 a ( 十) T h es e q u e n c eh o m o l o g ya f l a j y s i ss h o w e dm a tt 1 ed e d u c e da n l n oa c i d si no p e n r e a d i n gf r a m eh a d1 3a m
12、i n oa c i d ss u b s t j t u t i o n sc o m p a e dw i t ho m e r锄i n oa c i d ss e q u e n c eo fp g l u c a n a S ed e t e m l i n e db yB o r r j s sR ，s u n ，J ，H i d e t o s h i ，r e s p e c t i v e l y w h e nl h eS 订a i nw a Si n d u c e db yT P T G ，i tp r o d u c e d2 7 K Dp r o t e i na l
13、 】da c c u m u l a t e dl h ee n 掣m ei nt h ee x t m c e J J u J a r ，p e r i p l a s m i ca n dj n t r a c e l J u l a rs p a c e T h ee n 纠m ew a ss a I t e do u tf r o mt h eb r o t hu s i n g( N H 4 ) 2 s 0 4a n dp u r i f i e dw i t I lD E A Ec e l l u J o s e5 2 O n ec l e a rb a n dw a ss h o
14、 啪o n l es D s P A G Ea 1 1 dt h em o l e c u l a rw e i g h tw a sa b o u t2 7 K D T h ee n 巧m ep r 叩e n i e sw e r em e a s u r e d ，血er e s u l t si n d i c a t e d 山a tt h em e l t i n gt e m p e r a t u T e ( T I T l ) o ft h ee n 纠m ei s6 2 5 ；t h eo p t i m a lt e m p e r a t L I r c ( T o m
15、) o fe n 纠m ea c t j v i t yi s5 5 T h ed i r e c t e d s i t em e m b r a n et r a n s f e r r i “ga n dv i s u a ls c r e e n i n gm e t h o db a s e do np l a t ew e r eu s e d ，a n dt h ef a c t o r s ，w h j c ha f r e c tb a c t e r i u m 日o w I h ，e n z y m ee x p r e s s j o na n dt 1 es u c
16、c e s sf a t eo fm e m b r a I l et r a n s f e r r i n g ，w e r eo p t i m i z e dc od e v e l o pt h eh i 曲t h r o u g h p u ts c r e e n i n gm e t h o df o rt h e m os t a b I ep g l u c a n a S e T h er e s u l t ss h o w e d ：4 p l2 0 0m g ，m l I P T Gp e 。p l a t e ( 9 0 m m ) w a su s e d ；t h e1 P T Gs h o u l db ep l a t e dp r e V j o u s l y ；t h ec 0 1 0 n yd e n s i t yw a Sa b o u t1 0 0p
