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1、重庆医科大学博士学位论文DNA生物传感器快速检测病原微生物的实验研究姓名：鲁卫平申请学位级别：博士专业：临床检验诊断学指导教师：涂植光20090501重庆医科大学博士研究生学位论文的D N A 的直接、简便、快速检测方法进行了初步探索。实验的主要方法及结果如下：第一部分基于纳米金的标记型生物传感器同时检测多个病原性真菌1 通过查阅文献报道并进行临床调查，确定以2 0 余种临床常见的病原性真菌为检测目标，包括念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、皮肤癣菌世 号手O2 通过临床常见病原性真菌，包括酵母菌、浅部真菌和深部真菌共1 4 个属3 0 种真菌的核糖体R N A ( r i b o s o m a lR
2、N A ，r R N A ) 基因序列的比对，以真菌5 8 Sr R N A 基因和2 8 Sr R N A 基因的保守序列，设计真菌通用引物，可扩增真菌5 8 Sr D N A 部分序列、I T S2 ( 内转录间隔区2 ) 全序列、2 8 Sr D N A 的部分序列。利用该通用引物建立了真菌r R N A 基因通用P C R 扩增方法并进行了优化。该通用P C R 方法对2 0种靶真菌均可扩增出目的D N A 带，大小在2 5 9 5 3 1b p 之间。所有非真菌样品扩增结果均为阴性。3 为简化P C R 方法和减少标本用量，利用基因释放剂直接制备病原性真菌D N A 模板。该方法操作
3、非常快速、简单，整个模板制备过程仅需3 0 m i n 左右，而传统方法通常都需要2 h 以上。4 在相同条件下利用A l l e l e l D6 0 软件设计了针对各靶真菌I T S 2序列的种特异性寡核苷酸探针，利用生物信息学方法对所有探针进行分析筛选，并利用反向膜杂交技术进行验证。结果表明所选用探针特异性强、可靠性好，且探针间T m 值相差仅1 ，具有相同的杂交条件。4重庆医科大学博士研究生学位论文5 建立并优化了纳米金显色目视D N A 芯片检测系统，包括：最佳点样探针浓度；最适杂交温度、杂交时间；最佳银染显色方法；自身质量控制系统。该技术具有很好的特异性，对热带念珠菌扩增产物和白色
4、念珠菌的检测敏感性分别达到5 0 f m o l L 和1 0 c f u m l ，且检测结果可以用肉眼直接观察或普通光学仪器记录。6 为验证该检测技术用于临床样品检测的可靠性和实用性。用该检测系统对临床样品直接进行检测，分别检测了真菌感染标本的阳性培养物、加入标准菌株制备的模拟临床标本以及含菌的临床标本。本法的检测结果与常规经典检测鉴定方法结果一致；证明本检测方法准确可靠，可用于临床样品的检测。以上结果表明：我们建立的通用P C R 结合纳米金D N A 传感器技术，具有敏感、特异、操作简单快速的优点。整个检测过程可在6 h内完成，而传统方法需要2 4 天。与传统的基因芯片技术相比，其技术
5、和设备要求、检测成本大大降低。能部分满足临床检测的通量要求，适合在临床开展，有望成为临床微生物实验室传统真菌检测技术理想的替代方法。第二部分基于S P R 和b i s P N A 的非标记型生物传感器1 采用一种全新的二维S P R 折射率成像方法并行扫描光谱表面等离子体共振成像方法”。这项技术具有S P R 传感器一贯的高折射率灵敏度的特点，且能提供定量的被测平面的二维折射率分布图，其中每点的亮度值与折射率直接线性对应；本方法采用线形光束照明探测，一次探测一维区域，扫描探测二维平面区域，探测速度快，具有S重庆医科大学博士研究生学位论文很高的信息通量。2 针对流感病毒M 基因，设计合成了b
6、i s P N A 探针。其中H o o g s t e e n 链的C 碱基用J ( p s e u d o i s o c y t o s i n e ) 碱基检测替换，消除了C 碱基在杂交过程中需要质子化的影响，使探针在中性杂交环境中具有较好的稳定性，既保证其高结合率又有较好的特异性。3 将巯基修饰的b i s P N A 探针固定在金膜上，制成微阵列，直接与甲型流感病毒M 基因扩增产物杂交，然后进行S P R 扫描分析。该技术检测敏感性为l p m o l L 的双链D N A 分子。结合并行扫描光谱表面等离子体共振传感器系统和b i s P N A 技术，我们构建了一种无需任何标记的
7、生物传感器技术，并进行了初步验证。结果表明该方法可直接检测双链D N A ，无需对其进行变性处理。具有操作简单快速、检测通量高的优点。但目前离实际应用还有一段距离，在探针的设计、杂交条件、检测系统的稳定性等方面还需进一步优化提高。物关键词：D N A ，生物传感器，纳米金，表面等离子体，病原微生6重庆医科大学博士研究生学位论文E X P E R I M E N T A LS T U D I E So ND N AB I O S E N S o R SF o RR A P I DD E T E C T I o No FP A T H o G E N I C M I C R O O R G A M
8、 S M SA B S T R A C TT h eD N Ar e c o g n i t i o nt e c h n o l o g yi sc o n t i n u o u s l yi m p r o v e dw i t ht h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o l o g ya n db i o t e c h n o l o g y C o m p a r e dt ot r a d i t i o n a ld e t e c t i o nm e t h o d sb a s e do np h e n o
9、t y p i cc h a r a c t e r i s t i c so ft h ep a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m s ，t h em o l e c u l a rd i a g n o s t i ct e c h n i q u e sb a s e do nD N Ar e c o g n i t i o nt e c h n o l o g ya r et h ep r e f e r a b l ec h o i c ef o rt h ed e t e c t i o na n di d e n t i f i c
10、 a t i o no ft h ep a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s ms i n c et h e yc a no f f e rt h eh i g hs p e e d , s e m k i v i t ya n ds p e c i f i c i t y T h ei n f o r m a t i o no b t a i n e df r o mg e n o m es e q u e n c i n gp r o je c t sh a so p e n e dt h ed o o rt ot r e m e n d o u
11、 sb i o l o g i c a la n a l y s i sa n dd e t e c t i o n D N As e n s o rt e c h n o l o g yi n t e g r a t e sm o l e c u l a rb i o l o g yw i t hp h y s i c s ，c h e m ia n dm i c r oe l e c t r o n i (gYwithp h y s i c sc h e m i s t r ya n dm i c r o - e l e co n i ct e c h n o l o g y ，h a s
12、，a d v a n t a g e so fh i g hs p e e d ，s e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y ，a n dh i g ht h r o u g h p u t I tc a nb eu s e di nt h ef i e l d so fb i o l o g i c a le n g i n e e r i n g ，c l i n i c a lm e d i c i n e ，e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ，f o o d s t u f fa
13、 n a l y s i s ，a n dS Oo n A c c o r d i n gt ol a b e lo rn o t ，t h eD N Ab i o s e n s o r sC a nb ed i v i d e di n t ot w oc a t e g o r i e s ，o n ei sl a b e l b a s e dD N Ab i o s e n s o ra n da n o t h e ri S1 a b e l f r e eb i o s e n s o r T h el a b e l - b a s e dD N Ab i o s e n s
14、o ri sb a s e do ，nc h a n g e so fo p t i c a la n de l e c t r o c h e m i c a ls i g n a lc a u s e db ys i g n a l i n gm o l e c u l e T h el a b e l f r e e7重庆医科大学博士研究生学位论文b i o s e n s o ri sb a s e do nc h a n g e so fo p t i c a l ，m a s so re l e c t r o c h e m i c a ls i g n a lc a u s e
15、 db yh y b r i d i z a t i o no fn u c l e i ca c i d T h ed i s s e r t a t i o ni n c l u d e st w op a r t s I np a r tI ，e m p l o y i n gt h er i b o s o m a lg e n e - t y p i n gt e c h n o l o g y ，D N Ab i o s e n s o rt e c h n o l o g ya n dn a n o - a m p l i f i c a t i o nt e c h n i q
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