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1、微生物学通报 AUG 20, 2009, 36(8): 11051109 Microbiology 2009 by Institute of Microbiology, CAS 基金项目：广东省关键领域重点突破招标项目(No. 2006A25005001); 广东省科技计划项目(No. 2006B36301001) * 通讯作者：Tel: 86-20-287688132; : , 收稿日期：2008-09-10; 接受日期：2008-12-08 研究报告三种金黄色葡萄球菌显色培养基检测效果的比较 黄汝添1,2 吴清平1* 张菊梅1 郭伟鹏1 吴许文1(1. 广东省微生物研究所 广东省菌种保
2、藏与应用重点实验室 广东 广州 510070) (2. 广东环凯微生物科技有限公司 广东 广州 510070) 摘 要: 本文研究 2 种国外主流的金葡菌显色培养基和广东环凯微生物科技有限公司生产的PEN-TCF 检测金葡菌的效果。通过研究 3 种产品对多种金葡菌菌株的回收率、最低检出限以及检测人工污染食品的回收率、特异性和抗干扰能力比较其检测效果。结果表明 3 种培养基的最低检出限相近, 显色培养基 A 和 PEN-TCF 的回收率较高, 但抗干扰能力较低; 显色培养基 B 回收率稍低, 而抗干扰能力较强; PEN-TCF 和培养基 B 的特异性更优于培养基 A。 关键词: 金黄色葡萄球菌,
3、 显色培养基, 检测比对 Comparison of the Detection Effect of Three Chromogenic Media of Staphylococcus aureus HUANG Ru-Tian1,2 WU Qing-Ping1* ZHANG Ju-Mei1 GUO Wei-Peng1 WU Xu-Wen1(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Institute of Microbiology, Guan
4、gzhou, Guangdong 510070, China) (2. Guangdong Huankai Microbial Science and Technology Corporation, Guangzhou, Guangdong 510070, China) Abstract: Two current main chromogenic media products of abroad and the newly developed PEN-TCF from Guangdong Huankai Microbial Sci. 并用PCR扩增其凝固酶基因、热稳定DNA酶基因和金葡菌特异片
5、断Sma I的方法确认其均为金葡菌3。 1.2 主要试剂 1.2.1 显色培养基 A: 由法国公司开发, 金葡菌菌落呈紫红色(Mauve), 杂菌被抑制或形成白色、浅蓝或深蓝色菌落, 总检测时间为 20 h24 h。 1.2.2 显色培养基 B: 由美国公司开发, 不需要灭菌或准备平板, 直接将1 mL检样液加入其产品的测试片中间再压片使检样液均匀分布及凝固, 后即可进行培养, 培养后金葡菌形成紫色菌落, 杂菌为黑色或蓝色。培养后一般需经 62C 热处理, 后再用SED 显色片检验金葡菌的热稳定 DNA 酶(以下简称为“TNase”)。金葡菌落能降解 SED 上的长链 DNA形成粉红色显色圈,
6、 因而能被鉴别。其总检验时间为 24 h27 h。 1.2.3 PEN-TCF: 由广东环凯公司开发, 金葡菌菌落的在 PEN 培养基上能产生卵黄降解透明圈, 培养后需热处理并以 TCF 显色片检测 TNase, 其原理与1.2.2 SED 相似, PEN-TCF 总检验时间为 20 h24 h。 使用到的食品购自超市, 其他试验材料购于广东环凯微生物科技有限公司, 或由其提供。 2 实验方法实验方法 2.1 对多种金葡菌菌株的回收率试验 把金葡菌株ATCC6538、CMCC26003、A、B、D、I、K、W的新鲜培养液以生理盐水分别稀释至浓度约为 103 CFU/mL的菌液, 用 0.2 m
7、L菌液分别涂布营养琼脂(下简称为“NA”)、显色培养基A、和PEN; 吸取 1 mL菌液加入 4 mL生理盐水中, 混匀后吸取 1 mL加入显色培养基B, 再压片。上述试验均做 2 个平行, 37C培养 24 h后观察结果, 计数各种培养基上生长的总菌落数, 计算回收率。 2.2 三种培养基最小检出比对 用生理盐水稀释 ATCC 6538 金葡菌菌液到不同浓度, 按照 2.1 方法对三种显色培养基最小检出量比对试验。 2.3 人工污染食品的检测 2.3.1 制备菌液: 分别挑取金葡菌株ATCC6538 和CMCC26003 的新鲜菌苔制成菌悬液, 以生理 盐水稀释至 7.5104 CFU/mL
8、, 等量混合后作为污染菌液。 2.3.2 样品处理: 用巧克力蛋糕、 5 种冷冻饺子、 多种凉拌菜、豆腐和油炸豆腐作为检测样品, 购回后马上以无菌的手段切碎成约 0.2 cm3的碎片。 以 2 mL 2.3.1 菌液污染 25 g样品并搅拌混匀, 室温(约 18C)放置 10 min, 备用。 2.3.3 检样: 用 225 mL 无菌生理盐水中对 2.3.2 样品进行检样, 按照 2.1 方法检测检样液, 各做 2 个平行试验, 37C 培养 24 h 后观察结果, 计数 NA 平板上的总菌数、显色培养基上生长的显色阳性菌落数和不显色的杂菌菌落数。 2.3.4 金葡菌阳性对照: 吸取 2 m
9、L 2.3.1 菌液加入248 mL 生理盐水中混匀, 吸取 0.2 mL 涂布 NA, 做2 个平行试验, 37C 培养 24 h, 计菌落数作为阳性对照。 2.3.5 确认试验: 随机挑取每个显色培养基上的 20个阳性菌落进行革兰氏染色和镜检, 若不是G+球菌则判断为假阳性; 若是, 则转接肉汤培养后进行血浆凝固酶试验, 若为阴性, 则判断为假阳性; 若为阳性, 则判断为金葡菌。将分离到的假阳性菌用法国生物梅里埃API生化鉴定产品进行鉴定。 黄汝添等: 三种金黄色葡萄球菌显色培养基检测效果的比较 1107 http:/ 3 实验结果实验结果 3.1 对金葡菌纯菌的检出回收率比对 回收率=(
10、显色培养基菌落数/NA 上菌落数) 100%, 若数值大于 100%计为 100%。 从表 1 可看出, PEN-TCF 对多种金葡菌株平均回收率最高。 3.2 三种培养基最低检出限比对结果 如表 2 所示, 3 种培养基的最低检出限均为 8.3 CFU/mL(检测 0.2 mL 菌液)。 3.3 人工污染食品的检测回收率比对 根据 2.3.4 阳性对照结果, NA 平均生长 139 个菌落, 则理论上 2.3.3 每个显色培养基最多检出139 个阳性金葡菌落。以此计算 3 种显色培养基的回收率: 回收率=(显色培养基中阳性菌落数/139)100%, 若阳性菌落数大于 139, 也按照 100
11、%计算。从表 3 可看出, 显色培养基 A 回收率最高。 3.4 检测人工污染食品的抗干扰能力比对 根据 2.3.3 NA 上的总菌数和显色培养基上(不显色的)杂菌菌落数计算抗干扰能力。 NA 杂菌菌落数=NA 总菌落数金葡菌菌落数(=139, 见 3.3); 抗干扰率=(1显色培养基杂菌菌落数/NA 杂菌菌落数)100%。从表 4 可看出, 显色培养基 B 的抗干扰能力最强。 3.5 检测人工污染食品的特异性比对 如表 5 所示, 显色培养基 B 和 PEN-TCF 均没有发现假阳性; 显色培养基 A 上部分紫红色的阳性菌落在 2.3.5 确认试验中判别为假阳性, 从凉拌菜和油豆腐样品中分离
12、的假阳性菌落经鉴定分别为腐生葡萄球菌和棒状杆菌属, 可见显色培养基 A 的特异性较低。 表 1 对金葡菌纯菌的回收率试验结果 Table 1 Recovery of different Staphylococcus aureus strains 培养基 Media Standard strain ATCC 6538 Standard strain CMCC 26003 Wild strain A Wild strain B Wild strain D Wild strain I Wild strain K Wild strain W 各种培养基的 平均回收率 Average recovery
13、of 4 media (%) PEN-TCF 154 (100) 113 (100) 153 (92.7) 112 (91.8)146 (79.8)215 (100) 147 (79.9)115 (95.0) 92.4 显色培养基 A Chromogenic media A 160 (100) 101 (89.4) 171 (100) 66 (54.1)126 (68.9)94 (49.0)106 (57.6)98 (81.0) 75.0 显色培养基 B Chromogenic media B 115 (97.5) 45 (39.8) 123 (74.5) 110 (90.2)108 (59.
14、0)212 (100) 136 (73.9)57 (47.1) 72.8 NA 118 113 165 122 183 192 184 121 100 注: 表 1 中的数据为各种金葡菌菌株在不同的培养基上生长的菌落数平均值(CFU/皿), 括号中为其回收率(%). Note: Data in the table 1 are colony amounts of different Staphylococcus aureus on 4 media (CFU/plate), and the data in bracket below show their recovery (%). 表 2 显色培
15、养基最低检出限 Table 2 Minimum detection limit of chromogenic media 金葡菌菌液浓度 Concentration of Staphy- lococcus aureus solution (CFU/mL) 8.31038.31028.31018.3 8.310-18.310-2PEN-TCF + + + + 显色培养基 A Chromogenic media A + + + + 显色培养基 B Chromogenic media B + + + + 注: 表中“+”表示检出金葡菌, “”表示未检出. Note: “+”shows Staphylococcus aureus being detected, while “”shows not. 1108 微生物学通报 2009, Vol.36, No.8 http:/ 表 3 显色培养基检测人工污染食品的
