几种蛋白质含量测定方法的比较

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1、几种蛋白质含量测定方法的比较【摘要摘要】：蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford）， Folin酚试剂法（Lowry）杜马斯燃烧法。其中 Bradford 法灵敏度颇高，比紫外吸收法 灵敏 1020 倍,比 Biuret 法灵敏 100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往 往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去 Folin酚试剂法法是应用最 广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以在本公司订购），近年来逐 渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产

2、品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定 氮法所代替，杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ），通过控制进氧量、氧化消解 样品的原理而进行氮测定的。这 6 种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质， 每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间【关键词关键词】：凯氏定氮法凯氏定氮法 双缩脲法双缩脲法 紫外吸收法紫外吸收法 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 FolinFolin酚试剂法酚试剂法 杜马斯燃烧法杜马斯燃烧法 一 、凯氏定氮法1.1 原理凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定 4

3、 个过程。其原理是样品 中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸 作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴 定求出总氮量换算为蛋白质含量。1.2 特点凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准 确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消 化条件为硫酸铜 2.50 g, 硫酸钾 0.10 g,浓硫酸 4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间 的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间 仅为 12 min；与其

4、他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂 用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。 若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效 率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。二 、双缩脲法(Biuret )2.1 原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经 180 左右加热,放出 1 个分子氨后得到的 产物。在强碱性溶液中,双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰 胺基或两个直接连接的肽键

5、,或能够以 1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲 反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关, 故可用来测定蛋白质含量。2.2 特点双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响, 采用 0.5 g 样品,40 mL 双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,不 受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一,方法简便，但灵敏度差，测定范围为 120 mg 蛋白质。适用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白 质含量测定。三 、紫外吸收法3.1 原理蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基

6、的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有 吸收紫外光的性质,吸收峰在 280 nm 处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此 外,蛋白质溶液在 238 nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的 光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。3.2 特点最常用的紫外吸收法是 280 nm 的光吸收法，含有核酸的蛋白质溶液使用 280 和 260 nm 的吸收差法较好。蛋白质的稀溶液采用 215 与 225 nm 的吸收差法。紫外吸收法简便、 灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。特别适用于柱 层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定

7、蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。缺点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量 时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于 用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫 外光的物质,会出现较大的干扰。核酸在紫外区也有强吸收，但通过校正可以消除。但是因 为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的 误差。此外,进行紫外吸收法测定时, 由于蛋白质吸收高峰常因 pH 的改变而有变化,因此 要注意溶液的 pH 值,测定样品时的 pH 要与测定标准曲线的 pH

8、相一致。四 、考马斯亮蓝法( Bradford)4.1 原理Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料， 在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和芳香族氨 基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从 465 nm 变为 595 nm, 蛋白质在 11 000 g 范围内, 蛋白质色素结合物在 595 nm 波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用 于蛋白质的定量测定。4.2 特点考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合反应十分迅速而稳定,2 min 左右即达到平衡,其结 合物室温下 1 h 内保持稳定，且在 520 min 之间

9、,颜色的稳定性最好。该法方法简便,易 于操作,所用试剂较少,显色剂易于配制。干扰物质少,如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均 不影响显色。此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用 - 球 蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用 Beer 定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。该方法适用于要求灵敏度高、 快速定量测定微量蛋白质的测定。五 、Folin酚试剂法（Lowry 法）5.1 原理Lowry 法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应

10、用最广泛的一种方法，由 于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以在本公司订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所 取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin酚试 剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因 是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin酚试剂中的磷钼酸盐 磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物） 。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。5.2 特点Folin酚试剂法最早由 Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领 域得到广泛的应用。这个测

11、定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间 较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质 较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 Lowry 反应。而且对后者的影响还要 大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓 度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%）， 乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。 含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显 色后会色浅，则必须提高碳酸钠

12、氢氧化钠溶液的浓度 12 倍。六 、杜马斯燃烧法6.1 原理Dumas 法的基本原理是样品在 9001200高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体， 其中的干扰成分被一系列适当的吸收剂所吸收， 混合气体中的氮氧化物被全部还原成分子 氮，随后氮的含量被热导检测器检测。燃烧，杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ） ，通过控制进氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定的。燃烧生成的气体被载气 CO2 携 带直接通过氧化铜作为催化剂） 而被完全氧化。 此外， 化合物中一定量的难氧化部分会 被载气携带通过作为催化剂的氧化铜和铂混合物进一步氧化。还原，燃烧生成的氮氧化物 在钨上还原为分子氮，同时过量的氧也被

13、结合了。一个传感器用来控制最佳燃烧所需的氧 气量，这可以保证氧气和钨的消耗量最少。净化，一系列的适当的吸收剂将干扰成分如卤 化氢从被检测气流中除去。随后的水冷器确保水蒸气的去除。由于用 CO2 作载气,所以没必 要吸收燃烧生成的 CO2。检测，用一个 TCD 热导检测器来检测 CO2 载气流中剩余的氮。N2 体积含量引发一种电子测量信号，通过它，再经过物质的独立校正，被测样品中的氮含量 就自动的计算、打印和存储起来。6.2 特点用杜马斯快速定氮仪每个测试只需 3 至 5 分钟,并可以通过自动进样器连续进样,不需 要人看管;不需要复杂的样品前处理过程;不产生有毒有害物质；操作简便。七 、结语种蛋

14、白质测定方法比较如表 1 所示方法灵敏度时间原理说明凯氏定氮法灵敏度低，适用于0.21.0mg费时，810h将蛋白质转化为氮，酸吸收后滴定用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法灵敏度低适用于 120mg中速，810h多肽键+碱性Cu2+形成紫色络合物用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏快速 510min蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在处的光吸收用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正考马斯亮蓝法非常灵敏快速 515min考马斯亮蓝燃料与蛋白质结合时，光波由 465nm 变为 595nm干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随蛋白质不同而变化Folin酚试剂法

15、（Lowry 法）非常灵敏费时多肽键+碱性Cu2+形成紫色络合物灵敏度高；费时；专一性较差；干扰物质较多杜马斯燃烧法灵敏度低最快 35min燃烧过程中产生混合气体，混合气体中的氮氧化物被全部还原成分子氮，随后氮的含量被热导检测器检测不产生有毒有害物质；操作简便可以通过自动进样器连续进样广泛用于农产品中粗蛋白含量的测定参考文献1 李晓艳. 浅谈凯氏定氮法测定食品中蛋白质注意事项J . 计量与测试技术 2008 年第 35 卷第 8 期2 张厚锋 张淑萍. 双缩脲法和凯氏定氮法测定饲料中蛋白质含量的比较研究 - 中国饲料料 2008(7)3 陈革. 改良双缩脲法测定饲料蛋白质的应用研究 期刊论文

16、-饲料工业2003(3) 4 王雅 蛋白质测定实验的研究 期刊论文 -实验室研究与探索2005(4) 5 杨家华.谢占玲.愈芳.赵国珍 考马斯亮兰法测定西宁市售主要四种袋装牛奶的蛋白 质含量 期刊论文 -青海师范大学学报（自然科学版）2008(4 6 郭颖娜.孙卫 蛋白质含量测定方法的比较 期刊论文 -河北化工2008(04) 7 李宁. 几种蛋白质测定方法的比较 期刊论文-山西农业大学学报(自然科学版) 2006 26(2) 8 罗芳. Folin-酚试剂法蛋白质定量测定 期刊论文-黔南民族师范学院学报- 2005年3期 9 范志影.周陈维.杜马斯燃烧定氮法在农产品品质检测中的应用-期刊论文现代科学 仪器 2006.1