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1、?世界科学技术? 中医药现代化 综? 述?!W orld Science and T echnology /M odernization of TraditionalChineseM edicine andM ateriaM edica?丹参中丹酚酸 B的提取分离 及分析方法研究进展# 孙金兰 ? 韩 ? 伟?(华东理工大学药学院中药现代化工程中心? 上海 ? 200237)? ? ? 收稿日期: 2006?05?31? ? ? 修回日期: 2006?08?30? ? ? 联系人: 韩伟, 教授, 硕士生导师, 中药现代化工程中心常务副主任, 研究方向: 中药制药工程, E?mai:l wha
2、n ecust . edu. cn 。摘 ? 要: 系统综述了提取、 纯化、 分析丹参中治疗心脑血管病的有效成分丹酚酸 B的方法, 并对微 波提取、 超临界流体萃取、 大孔树脂吸附技术与传统技术上作了比较和论述。关键词: 丹参 ? 丹酚酸 B? 提取? 纯化 ? 分析方法? 丹参中药材取自唇形科植物丹参 ( Salvia m iltior?rhiza Bunge)的根, 在中医临床上, 丹参主要用来治疗冠心病、 脑血栓、 肝炎及肝硬化等。该药长期的临床应 用背景及在治疗疾病方面的明显效果, 引起了国内外学者对其水溶性酚类化合物的重视。丹酚酸 B是丹参水溶性成分中最主要的活性物质, 其含量较高,
3、 占丹参药材的 2 % 8 % 1。丹酚酸 B的活性很强, 对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显的保护作用, 还具有抗血小板聚集并对血栓形成的作用, 因此, 丹酚酸 B的提取技术的研究受到了医药界的关注。本文对丹酚酸 B的提取和分析方法的发展进行综述。一、 丹酚酸 B的提取目前, 丹酚酸 B是从丹参水溶性成分中分离得到 的, 因此要先提取丹参水溶性成分。丹参的水溶性成分主要以水、 甲醇、 乙醇或醋酸乙酯为溶剂来提取。传统的提取方法是水提醇沉, 这也是目前制备丹参注射液及口服液的主要方法。随着科技的发展, 一些新技术也用于丹酚酸的提取, 如微波提取、 超声波提取和超临界 CO2提取。1 . 传统水
4、煎法富志军等 2在复方丹参提取工艺的研究中, 考察了药材粒度、 加水量、 浸泡时间、 煎煮时间、 煎煮次数对 总酚酸含量的影响, 采用正交试验设计筛选出最佳提取工艺: 将药材粉碎过 20 目筛, 加 8倍量水浸泡1?5h , 煎煮 2次, 第 1次 1 . 5h , 第 2次加 6倍量水, 煎1?0h 。关昕等 3在丹参注射剂提取工艺研究中采用两种工艺流程: 原工艺和新工艺。原工艺采用两次醇沉:第一次醇含量为 75%, 第二次醇含量为 85 %, 新工艺采用一次醇沉, 醇含量达 60 %, 上大孔树脂吸附。用高效液相色谱和比色法分别测定丹参素和总酚酸的含量。结 果 表明, 新 工艺 较 原工
5、艺 丹 参素 提 高 了23?1 %, 总酚酸提高了 19 . 7 %。2 . 超声波提取法王凤美等 4将精密称取的丹参细粉分别用 30 %49?2007? 第九卷? 第一期? Vo.l 9 No . 1? !World Science and T echnology /M odernization of TraditionalChineseM edicine andM ateriaM edica乙醇, 50 %乙醇, 70 %乙醇, 100 %乙醇, 30 % 甲醇, 50 %甲醇, 70 % 甲醇, 100 % 甲醇及水各 30mL 冰浴超声处理, 计算丹酚酸 B的提取量。结果表明, 丹参
6、生药中丹酚酸 B的提取以 70 % 甲醇为溶剂提取率最高; 其次 为 70 %乙醇, 其提取率为 70 % 甲醇的 98 . 8 % 。但这几种提取溶剂差异并不特别显著, 水的提取率相对较低, 为 70 % 甲醇的 95 . 06 %。由于水作溶剂成本较低, 又不会造成环境污染, 所以他们认为丹酚酸 B直接用水提取较好。3 . 回流提取法 回流提取法是目前提取水溶性酚类化合物的主要方法之一。刘重芳等 5准确称取丹参药材, 以丹参素、 原儿茶醛和丹参酮 A为指标成分, 用正交试验设计对提取工艺进行优化, 考察乙醇浓度、 乙醇量、 回流 时间和提取次数对指标成分含量的影响, 应用高效液相色谱法测定
7、其含量。得出最优工艺: 用 10倍量50%的乙醇回流提取 2次, 每次 1 . 5 h , 所得的 3种指 标成分含量较高。张启伟等 6精密称取丹参粉末, 用 75 % 的甲醇水浴回流提取, 采用高效液相色谱法测定丹酚酸 B的含 量。色谱柱是 YWG- C18, 流动相为甲醇 - 5% 乙酸,流速为 1 . 0mL /m in , 检测波长为 281 n m。丹酚酸 B在0 . 17 1 . 70?g 范围 内呈 良 好的 线性 关 系 ( r =0?9997), 回收率为 98. 9 % , RSD= 1 . 82 %。该法可作 为丹参及其制剂的质量控制的分析方法。4 . 超临界 CO2萃取
8、萧效良 7在超临界 CO 2萃取技术提取中药有效 成分的研究中, 采用了不同的表面活性剂和夹带剂。研究中他们先以第一种夹带剂进行萃取, 获取了以丹参酮类为主的脂溶性活性物质。待丹参酮类物质基本 萃取完毕后改用第二种夹带剂继续萃取, 获取了以丹参素、 原儿茶醛为主的水溶性活性物质。丹参酮 A提取物的含量大于 20 % , 水溶性提取物的含量大于 35%, 收率为常规法的 2倍以上, 而且工艺简单。李霞, 唐玉海等 8研究了超临界 CO 2流体对丹参中有效 成分的萃取, 并与回流提取法、 超声提取法进行了比 较, 结果是超临界法萃取的成分最多, 萃取效率也高于其它两种方法。5 . 微波提取朱晓薇
9、9等人研究了微波提取丹参的优化工艺。他们以丹参的脂溶性成分丹参酮 A、 水溶性成分丹参素、 原儿茶醛为指标, 用正交试验设计法对丹参的微 波提取工艺进行了优化, 考察了提取时间、 微波功率、加水量三个因素的三个水平, 并与传统工艺比较。丹参以 6倍量 95%的乙醇, 在微波功率为 320 W 的条件 下提取 30m in , 药渣再以 12倍量水, 微波提取两次。以丹参酮A、 丹参素和原儿茶醛三种成分的提取量为指标, 结果表明: 其提取量相当于或优于传统方法。焦士龙等 10应用微波萃取丹参活性成分, 以丹参脂溶性成分丹参酮 A和水溶性成分丹参素、 原儿茶醛为指标成分, 高效液相色谱法测定其含量
10、, 并与传统回流法比较。研究中他们采用均匀设计法对丹参的微波提取工艺进行优化, 考察提取水量、 辐射时间和微波 功率的影响, 得出最优条件为 12倍量的水提取药渣两次, 每次 60m in, 微波功率 320 W, 提取量分别为传统回流法的 1 . 297倍和 1. 26倍。 6 . 浸渍法浸渍法有冷浸法和温浸法两种。冷浸法即常温下浸泡; 温浸法是指温度高于常温下的浸泡。李静 11以原儿茶醛、 咖啡酸、 迷迭香酸及其甲酯、 丹酚酸 A、 B和 C 7种有效成分的含量为指标, 考察了不同的溶剂 -酸性丙酮、 酸性甲醇、 酸水对提取率的影响, 发现水为溶剂提取率最高。如果以丹酚酸 B为指标, 酸性
11、甲醇 的提取率最高。进一步考察了不同的提取方法 - 冷浸、 热提、 超声提取的影响, 结果表明热提的效果最好。韩丽 12设置温浸温度为 70% , 考察了温浸提取时水的用量、 提取时间、 提取次数对丹参水溶性成分的 提取效果的影响。他们采用三因素三水平的正交试验, 以总酚酸为指标, 筛选出最佳工艺条件: 用水 70%时温浸提取 3次, 第 1次为 12倍量水, 后 2次为 10倍 量水, 每次 2h 。结果表明: 总酚酸的含量温浸法较传统回流法低。7 . 渗漉法匡荣仁 13在香丹注射液指纹图谱研究中, 称取定量丹参, 加适量水, 使丹参被水浸没, 置冰箱冷冻, 待结冰后取出, 冰融后装渗漉筒,
12、 收集渗流液, 其最佳工艺50?世界科学技术? 中医药现代化 综? 述?!W orld Science and T echnology /M odernization of TraditionalChineseM edicine andM ateriaM edica?为在冰冻条件下收集 24倍量的渗漉液, 以丹参素和原儿茶醛为指标, 指标成分含量较高。8 . 其它方法韩丽 12应用逆流提取与膜分离技术研究丹参粉针工艺, 用动态循环逆流提取丹酚酸。动态循环逆流提取由几个相等的提取单元组成, 每个提取单元进行独立作业, 采用机械强制循环方式, 使溶剂从提取罐底 部进入, 经罐内颗粒状物料产生湍流,
13、 由罐顶部溢出,连续循环, 流动浸出, 提高固液扩散界面层的更新速度, 使药材组织中的溶质与浸出液中的溶质在单位时间内能保持一个较高的浓度差。当某一阶段提取过程 完成时, 不饱和溶剂隔一个单元迁移继续循环提取, 以增加物料与溶剂中有效成分的浓度差。最终确定的提取条件是: 水为溶媒, 药材粒度 1 8mm, 提取温度60% 。以总酚酸为目标产物, 动态循环逆流提取与单 罐逆流提取效果相差不大, 含量较回流法略低。二、 丹酚酸 B的分离与纯化丹参水提物是一多组分的混合物, 提取液中含有丹酚酸 A、 B、 C及紫草酸、 咖啡酸、 丹参素、 原儿茶醛和原儿茶酸等。当前丹参提取液精制分离最常用的方法是醇
14、沉, 通过几次不同浓度的醇沉除去提取液中大量 的鞣质, 但这种方法所需醇量大, 有效成分损失严重。除了醇沉法外, 还有萃取法、 大孔树脂吸附法等。1980年, 陈政雄等 14用乙醚萃取丹参注射液, 乙 醚层浓缩析出原儿茶醛; 水层用饱和食盐水盐析, 过滤盐析物, 滤液放置得到白色沉淀, 在水中重结晶得丹参素, 即丹参酸甲; 盐析物酸化, 用醋酸乙酯溶解振摇, 溶剂层减压浓缩后进行纤维粉柱层析, 用 0 . 001mol/L的 硫酸冲洗, 洗脱部分再用醋酸乙酯萃取, 取醋酸乙酯层进行制备性薄层层析, 得到丹参酸乙 (即丹酚酸 B或紫草酸 B)和丹参酸丙。这是我国学者首次分离得到 的丹参酸甲、 乙
15、、 丙。叶勇等 15发明了从丹参中提取酚酸各组分的方法。以热水短时间浸提, 浸提液合并后离心, 上清液超滤, 滤液过反相柱, 或用乙酸酯类萃取经酸化后的水提 液, 分离有机相回收溶剂后, 过反相柱, 获得不同组分。此提取方法稳定, 收率高, 利用此发明工艺得到丹酚酸组分, 纯度高, 性能稳定。周永刚等 16用 SIPI905型大孔树脂提取分离丹酚酸 B, 用毛细管电泳法测定其含量, 考察了大孔树脂吸附的最佳工艺条件。其结果是: 丹酚酸 B的吸附容量 为 8 . 72mg/g , 洗脱液为 4倍量 20 %乙醇。大孔树脂对丹酚酸 B的洗脱率为 96. 28 % , 精制程度为 251 . 82
16、%。此方法能明显提高丹酚酸 B的收率和纯度。 张军等 17用 F型大孔树脂吸附丹参药材提取液中丹酚酸, 以丹酚酸 B为指标, 考察了丹参提取液在大孔树脂吸附工艺中的动态吸附曲线以及最佳洗脱条件。最大上样量 (以丹酚酸 B计 )为 87 . 9 mg/g干树 脂, 以 3倍柱体积 60 % 乙醇为洗脱溶媒, 吸附 - 洗脱过程中丹酚酸 B的平均保留率可达 93 . 7 %, 固形物得率由过柱前的 41 %以上降低为过柱后的 8%左右。该方法在有效地保留丹酚酸 B的同时, 可显著降低固形 物的得率。王凤美等 18在制备高纯度丹酚酸 B的工艺中, 通过比较几种不同大孔吸附树脂对丹酚酸 B的吸附及 洗脱性能, 筛选出最佳树脂并对该树脂分离纯化丹酚酸 B的工艺参数进行了优化。在确定的最佳工艺条件下, 丹酚酸 B回收率为 90 . 6 % , 纯度高达 91 . 8 % , 稳定性良好, 可作为丹参制剂的原料药应用。 冯彩丽 19将丹参提取液的醋酸乙酯萃取物进行硅胶层析, 用溶剂系
