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1、实验五 真核细胞 RNA 的提取 一原理 本方法利用盐酸胍抑制 RNA 酶，匀浆裂解细胞，采用有机溶剂抽提去除 蛋白质。通过选择性沉淀 RNA 分子去除 DNA。 二方法 1.样品处理 组织样品处理：取新鲜的组织样品称重后，剪碎成约 1cm2的组织块直接 加入匀浆液中进行 RNA 提取，或液氮中速冻-70保存。 贴壁培养细胞处理：用 PBS 洗细胞一次，吸干溶液后将培养板快速移至 液氮中冷冻后转到-70保存；或加入 1ml 匀浆至培养板中直接裂解细胞，然后 将粘稠的裂解液进一步匀浆。悬浮培养细胞处理：离心收集细胞，用 PHS 悬浮漂洗再田心收集，若不 立即提取 RNA，则可经液氮速冻后转至一
2、70贮存备用。2加 l()倍体积盐酸胍匀浆液至准备好的样品细胞中，高速匀浆 1min。3匀浆液 5000g，室温离心 10min。4将上清移至一个干净离心管中，加入 0.1 体积的 3molL 乙酸钠 （PH5.2） ，混匀，再加 5 体积预冷的乙醇，立即充分混匀，-20放置至少 2 小 时。55000g 0离心 10 分钟沉淀核酸，弃上清液，室温干燥。6，每个提取 RNA 的组织或细胞样品中，加入 l015min 盐酸胍匀浆液 ，搅拌溶解。7加入 2.5 体积预冷的乙醇，立即充分混匀，-20至少放置 2 小时。85000g 0离心 10 分钟沉淀核酸，去上清，室温挥发乙醇。9按每克组织细胞加
3、 5min 的比例分两次加入 0.02molL EDTA(pH8.0) 先加 12 体积 EDTA 振荡 l2 分钟，3000g 离心 2min吸出上清再加另一 个 1/2 体积的 EDTA 振荡 l 一 2 分钟合并两次核酸溶解液。 10用等体积氯仿正丁醇(4：1)抽提核酸溶液，5000g 室温离心 l0min，5000g 室温离心 10min。吸出上清至另一个干净离心管中。 11加 3 倍体积 lmolL 乙酸钠 (PH7.0) 混匀，-20放置 1h 以上，此时 RNA 将选择地沉淀，而 DNA 仍为溶解状况。125000g，0离心 20min，沉于管底的是 RNA。 13吸去上清，用
4、4预冷的 lmolL 乙酸钠(pH70)漂洗 RNA 沉淀。然 后 20 5000g，离心 20 分钟。回收 RNA。 14尽量去除上清液。按每 g 组织细胞 1m 的比例加入 RNA 溶解液 (0.2SDS，0.5molL EDTA，pH8.0)。注意：若有 SDS 沉淀析出滴加 0.11molL NaOH 调溶液 pH 至 75。15加入 2 倍体积冰预冷乙醇混匀，0放置至少 2 小时，5000g，4离心 10 分钟，RNA 沉淀用 70乙醇漂洗，短暂离心后，弃上清，室温干燥蒸发乙醇。16用适当小容积 DEPC 处理过的 ddH2O 溶解 RNA 沉淀，加入 3 倍体积乙醇， -70保存
5、RNA 备用。用时加入 0.1 体积的 3molL 乙酸钠，混匀， 12000g，4离心回收 RNA。三三. .试剂试剂1盐酸胍匀浆液 成分：8molL 盐酸胍(分子量为 95.6)，O1molL 乙酸钠(pH52)， 5mmolL 2巯基乙醇，0.5十二烷基肌氨酸钠 配制方法：取 191g 盐酸胍加 8.35m1 3molL 乙酸钠(pH52)和 625ml 02molL 2琉基乙醇溶液中，再加水至 2375ml，混匀后加 125ml 10 十二烷基肌氨酸钠,振荡混匀溶解。 2盐酸胍匀浆液 成分：8molL 盐酸胍(分子量力 95.6),0.1molL 乙酸钠(pH52),1mmolL 2琉
6、基乙醇，20mmolL EDTA(pH8.0) 配制方法：取 191g 盐酸胍，加日35ml 3molI。乙酸钠(pH52)和 125ml 02molL 2巯基乙醇溶液中，再加入 10ml 0.5molL EDTA(pH8.0)。 加水至 250ml 混匀。 3.乙醇 4.70乙醇 5.氯仿正丁醇(4：l，体积比) 6.4molL 乙醇钠，pH7.0 7.3molL 乙醇钠，pH5.2 8.RNA 溶解液 成分：O2SDS0.05molL EDTA, pH8.0 四、说明提取 RNA 时，要特别注意防止 RNase 的污染，所用玻璃器皿均应用 0.1的二乙基焦 碳酸盐(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理。塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处 理，必要时，也可用 0.1%DEPC 处理。
