生物选修一第五六专题基础知识梳理

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1、1专题专题 5 DNA 和蛋白质技术和蛋白质技术课题课题 1 DNA 的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定一、基础知识（一）提取一、基础知识（一）提取 DNA 的方法的方法 提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理物理或化学化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于 DNA 的粗提取而言，就是要利用 DNA 与 RNA、蛋白质和脂质等在物理物理和化学化学性质方面的差异，提取 DNA，去除 其他成分。 （1）DNA 的溶解性： DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的 NaCl 溶液溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适 当的盐浓度就能使 DNA 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的

2、。 此外，DNA 不溶于酒精酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将 DNA 与蛋白质进 一步的分离。 （2）DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白蛋白质质，但是对 DNA 没有没有影响。大多数蛋白质不能忍受 6080oC 的高温，而 DNA 在 80以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细细胞膜胞膜，但对 DNA 没有没有影响。 （二）（二）DNA 的鉴定：的鉴定：在沸水裕沸水裕条件下，DNA 遇二苯胺二苯胺会被染成蓝蓝色，二苯胺可以作为鉴定 DNA 的试剂。二、实验设计二、实验设计 （一）实验材料的选取（一）实验材料的选取 凡是含有 DNA 的生物材料都可以考虑

3、，但是使用 DNA 含量相含量相对较对较高高的生物组织，成功的可能性更大。 （二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含 DNA 的滤液的滤液 动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量 的蒸蒸馏馏水水，同时用玻璃棒搅搅拌拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗洗涤剂涤剂溶解细胞膜。例 如，提取洋葱的 DNA 时，在切碎的洋葱中加入一定的洗洗涤剂涤剂和食食盐盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。（三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质 方案一 利用 DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度溶解度的不同，通过控制 NaCl 溶液的浓度去除杂质

4、。 方案二 直接在滤液中加入嫩肉粉，反应 1015min，嫩肉粉中的木瓜蛋白木瓜蛋白酶酶能够分解蛋白质。 方案三 将滤液放在 6075的恒温水浴箱保温 1015min，注意严严格控制温度格控制温度范围。 （四）（四）DNA 的析出与鉴定的析出与鉴定 1、将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的相等的、冷却冷却的酒精溶液（体积分数为 95%） ，静置 23min，溶液中会 出现白色白色丝丝状物状物，这就是粗提取的 DNA。用玻璃棒沿一个方向沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。 2、取两支 20ml 的试管，各加入物质的量浓度为 2mol/L 的 NaCl 溶液 5ml，将丝状物放

5、入其中一支试管中，用玻璃 棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入 4ml 的二苯胺二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水沸水中加热 5min，待试管冷却冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有 DNA 的溶液是否变蓝蓝。 实例：用鸡血细胞液粗提取实例：用鸡血细胞液粗提取 DNA 并鉴定并鉴定 步骤步骤操作操作图示图示1、提取鸡血、提取鸡血 细胞的细胞核细胞的细胞核 物质物质将制备好的鸡血细胞液（已在课前配好）510mL，注 入到 50ml 烧杯中。向烧杯中加入蒸蒸馏馏水水 20mL，同时用玻璃 棒沿一个方向快速搅拌 5min，然后，用放有纱布的漏斗将血 细胞过滤至 1000mL

6、的烧杯中，取其滤液。2、溶解细胞、溶解细胞 核内的核内的 DNA将物质的量浓度为 2molL 的的 NaCl 溶液溶液 40 mL 加入到 滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌 1min，使其混合均匀， 这时 DNA 在溶液中呈溶解状态。3、析出含、析出含 DNA 的粘稠的粘稠 物物沿烧杯内壁缓缓加入蒸蒸馏馏水水，同时用玻璃棒沿一个方向 不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏 水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时 停止加入蒸馏水。24、滤取含、滤取含 DNA 的粘稠的粘稠 物物用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至 1000 mL 的烧杯中。 取纱布上的黏稠物黏稠物。5、将、

7、将 DNA 的的 粘稠物再溶解粘稠物再溶解取一个 50 mL 烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为 2molL 的的 NaCl 溶液溶液 20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠 物夹至 NaCl 溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌 3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。6、过滤含、过滤含 DNA 的氯化的氯化 钠溶液钠溶液取一个 100 mL 烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上 溶液。取其滤液（DNA 溶于滤滤液液中） 。7、提取含杂、提取含杂 质较少的质较少的 DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却冷却的、体积分数为 95的 酒精溶液酒精溶液 50 mL（加入时动作要慢） ，并用玻璃棒沿一个方向

8、 搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现 丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将 丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。8、DNA 的鉴的鉴 定定取两支 20 mL 的试管，各加入物质的量浓度为 0.015molL 的的 NaCl 溶液溶液 5mL，将丝状物放入其中其中一支试 管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中 各加入 4 mL 的二苯胺二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水 中加热 5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液 颜色的变化。三、操作提示：三、操作提示： 1、以血液为实验材料时，0.3g/mL 柠柠檬酸檬酸钠钠作为作为防凝剂，防

9、止血液凝固血液凝固。 2、加入洗涤剂后，动作要轻缓轻缓、柔和柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒 搅拌时，动作要轻缓轻缓，以免加剧 DNA 分子的断裂分子的断裂，导致 DNA 分子不能形成絮状沉淀。 3、二苯胺试剂要现现配配现现用用，否则会影响鉴定的效果。四、课题成果评价四、课题成果评价 1、是否提取出了 DNA：观察你提取的 DNA 颜色，如果不是白色丝状物，说明 DNA 中的杂质杂质较多；二苯胺鉴定 出现蓝色说明实验基本成功基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的 DNA 含量低含量低，或是实验操作中出现错误错误，需要重新 制备。 2、分析 DNA 中的杂质

10、：本实验提取的 DNA 粗制品有可能仍然含有核蛋白核蛋白、多糖多糖、RNA 等杂质。 3、不同实验方法的比较：对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料， 其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如 DNA 的多少多少、颜颜色色，二苯胺显色的深浅深浅等，看看 哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。 五、课题延伸：五、课题延伸：本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的 DAN 时，通常使用十六十六烷烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵铵（ （CTAB） ）、十二十二烷烷基硫酸基硫酸钠钠（ （SDS） ）或吐温吐温等

11、化学试剂。六、思考题六、思考题 1为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀胀裂裂，再加上搅拌的机械作机械作用用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出 DNA。 2加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解溶解细细胞膜胞膜，有利于 DNA 的释释放放；食盐的主要成分是 NaCl，有利于 DNA 的溶解的溶解。 3如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 答：研磨不充分会使细胞核内的 DNA 释放不完全， 提取的 DNA 量变变少少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、

12、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 4此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白核蛋白、多糖多糖和 RNA 等杂质。 5为什么反复地溶解与析出 DNA，能够去除杂质？3答：用高盐浓度的溶液溶解 DNA，能除去在高在高盐盐中不能溶解的中不能溶解的杂质杂质；用低盐浓度使 DNA 析出，能除去溶解在低溶解在低盐盐 溶液中的溶液中的杂质杂质。因此，通过反复溶解与析出 DNA，就能够除去与 DNA 溶解度不同的多种杂质。 6DNA 与蛋白质的分离方法？ 答：利用蛋白蛋白酶酶分解杂质蛋白，从而使提取的 DNA 与蛋白质分开；利 用 DNA 和蛋白质对高温高温耐受性的不同，从而使蛋白质变变性性，与

13、DNA 分离。7图 5-1 是 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度曲线，请根据曲线图，思考下面的问题 在什么浓度下，DNA 的溶解度最小？DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度是如何 变化的？ 答：在 NaCl 溶液浓度为 0.14mol/L 时， DNA 的溶解度最小；当 NaCl 溶液浓度低于 0.14mol/L 时，随着 NaCl 溶液浓度的升高，DNA 的溶解度降低降低；当 NaCl 溶液浓度高于 0.14mol/L 时，随着 NaCl 溶液浓度的升高，DNA 的溶解度升高升高。 如何通过控制 NaCl 溶液的浓度使 DNA 在盐溶液中溶解或析出？答：根据 DNA 在 0.14mol/

14、L NaCl 溶液中溶解度最小的特性，一般先用较高浓度 2mol/L2mol/L 的 NaCl 溶液使 DNA 溶解，然后再用蒸馏水稀释至 0.14mol/L0.14mol/L 使 DNA 析出。8请解释提取 DNA 的实验操作中主要步骤的目的。 答：提取 DNA 的第一步是材料的选取材料的选取，其目的是一定要选取 DNA 含量较较高高的生物材料，否则会由于实验过程中 或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是 DNA 的释放和溶解的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使尽可能使细细 胞内的胞内的 DNA 全部溶解全部溶解；第三步是 DNA 的纯化的纯化，即根据 DNA 的溶解特性溶

15、解特性、对酶酶及高温高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将 DNA 与杂质分开；最后一步是对对 DNA 进行鉴定进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。 9你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取 DNA 一样容易吗？为什么？ 答：提取蛋白质比提取 DNA 的难度大。这是因为，与 DNA 相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH 等条件要敏感得多， 很容易失活失活；并且蛋白质的空间结构多种多多种多样样，理化性质各不相同各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。【知识拓展知识拓展】 1制备鸡血细胞液时，为什么要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠？ 答：制

16、备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂柠檬酸钠，防止血液凝固防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆 中 Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的 Ca2+大大减少，血液便不会凝固。 2鸡血离心或静置沉淀后，为什么要弃出上清液？ 答：因为上清液是血血浆浆，没有血细胞。DNA 主要存在于试管 底部的鸡鸡血血细细胞的胞的细细胞核胞核中，所以提取鸡血中的 DNA 时，要除去血液中的上清液。 3盛放鸡血细胞液的容器最好是塑料容器，为什么？ 答：鸡血细胞破碎以后释放出的 DNA，容易被玻璃容器吸 附，由于细胞内 DNA 的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的 DNA 就会更少。因此，实验 过程中最好使用塑料塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的 DNA 的损失。 4为什么析出 DNA 时要用冷却的酒精？ 答：预冷的酒精溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶的活性，防 止 DNA 降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于