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1、提取核蛋白方法提取核蛋白方法:1 称取适量材料(约 10 克)于 25 毫升研磨缓冲液 A 中研磨至匀浆, 六层纱布过滤,2300g 离心 10 分钟,弃上清.注意: 过滤得时候不要用手挤压.让它自然流出即可.2用重旋缓冲液 B (1.5 毫升)重旋,加入 260 微升饱和硫酸铵,于4 度轻摇 30 分钟,(可以将离心管放在冰盒里,然后把冰盒放在摇床里摇,转速设置为 100 转每分钟即可)312000g 离心 10 分钟,取上清至一新管,加入 3 倍体积的饱和硫酸铵,冰上放置 1 小时,每隔 20 分钟颠倒混匀一次, 这时可以看见一些絮状的蛋白漂浮在管中.412000g 离心,去上清,沉淀用
2、1ml 重旋缓冲液 C 重旋.取 20 微升蛋白电泳观察.考染后可以看到一片蛋白带,各种大小都有.5将蛋白过夜透析,透析液为蛋白-DNA 结合缓冲液 D6将透析后的蛋白分装,液氮速冻后零下 70 度保存.研磨缓冲液 ATris-Cl(pH7.8) 50mMMgCl2 5mMKCl 15mM蔗糖 0.3MEDTA0.1mMDTT1mMPMSF0.5mM重旋缓冲液 BHEPES-KOH (PH 8.0) 20mM甘油25%(体积比)EDTA 0.4mMPMSF0.5mMDTT1mM重旋缓冲液 CHEPES-KOH (PH 8.0) 20mM甘油25%(体积比)EDTA 0.4mMPMSF0.5mM
3、DTT1mMNaCl 0.1MDNA-蛋白结合缓冲液 DTris-Cl ph7.8 10mMNaCl 50mMDTT 0.5mMEDTA 1mM甘油5%体积比注意:上述缓冲液后面的浓度均为工作浓度,可以配置合适浓度的母液,在配置的时候加入母液即可.EMSA1 片段的标记片段的标记在感兴趣的片段两端设计含有合适酶切位点的引物在感兴趣的片段两端设计含有合适酶切位点的引物,用高保真酶进行用高保真酶进行扩增扩增,将将 PCR 产物沉淀后酶切产物沉淀后酶切,然后回收然后回收.利用末端补平酶进行补平利用末端补平酶进行补平.进进行标记行标记.反应体系如下反应体系如下10* BUFFER 1DNA Fragm
4、ent 210mMdA/T/GTP 1P32-dCTP4Klenow Fragment o.5水1.5其他物质先加好,然后加同位素,最后加酶.37 度标记一个小时.2 做蛋白和 DNA 结合结合体系为 20 微升标记的启动子片段 5 微升蛋白 5 微升Poly dI-dC2 微升xxxxxxxx8 微升25 度反应 1 小时根据不同的实验需要,可以设置不同的 XXXXXXX1 全部加水 只检测二者之间的结合2 加未标记的启动子片断,可以检测结合的特异性3 如果你标记的片断比较长,比如是 500bp,那么可以把这 500 分成 5 个 100,然后分别加入不同反应体系,根据结合的抑制情况,可以分析结合的具体位点.跑胶 制作非变性聚丙烯酰胺凝胶,根据片断大小设置合适的浓度,跑胶.跑完之后铺一层滤纸,小心揭下,晾干,压片.(这个飞哥肯定比我熟练,呵呵).第二天洗片子,观察结果.此外,张老师没有给我订购 Poly dI-Dc,我用的鳜精 DNA 替代,效果不好,非特异性结合很多,你们最好订购.我的实验结果没有扫描,就和你们说一下,就是下面有一条比较淡的 DNA 条带,上面有一条很粗大的结合滞后带,其他的没有了.
