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1、派森诺回馈新老客户：助力国家自然科学基金撰写 致正在撰写国家自然科学基金的各位老师的一封信 尊敬的各位老师，大家好！ 很多老师最近在致力于 2017 年国家自然科学基金的申报工作。 如果您申报的项目涉及到高通量测序技术， 在申报书中的“拟采取的研究方案及可行性分析”部分需要将研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等内容进行说明。如您并非专门从事高通量测序研究，可能会对这些内容产生困惑。下面，我们派森诺生物就将最可能涉及到的几种高通量测序产品的采集提取、建库测序和信息分析等内容进行说明，为您在国家自然科学基金的撰写过程中提供参考。 1 微生物组测序 1.1 研究方案 1.1.1 样品采集 微生物
2、组测序样品采集要求如下： 样品类型 样品要求 土壤类 取样后低温冻存，建议干冰运输，总量提供 1.5g 左右，如微生物含量少，可以适当增加送样量，并备注说明，但总量不超过 10g。 排泄物类 取样后低温冻存，建议干冰运输，总量提供 0.6g 左右，液体样本约 600ul左右，如微生物含量少，可以适当增加送样量，并备注说明，但总量不超过 10g。 水样类 取样后低温冻存，建议干冰运输，未过滤提供 500ml 左右，已过滤好的提供过滤相应体积水的滤膜，如微生物含量少，可以适当增加送样量。 核酸类 总量500ng，浓度10ng/ul，DNA 有明显主条带，无明显 RNA、蛋白质等污染 注：如需其他样
3、品类型的样品要求，请参考派森诺生物公司网站，或发邮件至市场部邮箱（）与我们联系。 1.1.2 微生物组测序分析 （1）微生物组总 DNA 提取 采用 QIAamp 粪便 DNA 提取试剂盒（QIAamp DNA stool mini kit）进行抽提（以粪便样品为例） ，并对抽提的 DNA 进行检测。采用荧光分光光度计（Quantifluor-ST fluorometer, Promega, E6090；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit, Invitrogen, P7589）检测 DNA 的浓度，并用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量。调整 DNA
4、溶液浓度，DNA 工作液保存于 4，储存液保存于-20。 （2）微生物组测序 以 16s rRNA 基因可变区的扩增子测序为例： 首先对 16s rRNA 基因可变区进行扩增：针对样本 DNA 特定 V 区进行 PCR 预试验；大批量 PCR 扩增 （Pyrobest DNA Polymerase, TaKaRa, DR500A） ； 然后进行胶回收纯化：针对目标条带进行割胶回收， 得到纯化的样本 （AxyPrep DNA Gel Extraction Kit, Axygen, AP-GX-500） ；然后进行各样本定量：利用 BioTek 酶标仪对各个样品定量（BioTek Flx800 酶
5、标仪；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit, Invitrogen, P7589） ；最后采用标准的Illumina TruSeq DNA 文库制备实验流程（Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide）构建所需的微生物组上机文库。 实验主要流程如下： 1） DNA 双末端修复： 利用 End Repair Mix 中 3-5核酸外切酶和聚合酶的共同作用，修复带有突出末端的 DNA 片段。 2） 3端引入“A”碱基：在修复平整的 DNA 片段 3端引入单碱基“A”。而在接头的3末端含有单碱基“T”， 从而保证 DNA
6、片断和接头能够通过“A”“T”互补配对连接，并防止接头连接 DNA 片段的过程中，DNA 插入片断彼此相连。 3） 连接接头：在连接酶的作用下，孵育含有标签的接头与 DNA 片段，使其相连。 4） 富集 DNA 片段： 利用 PCR 选择性地富集两端连有接头的 DNA 片段， 同时扩增 DNA 文库。PCR 应尽量使用较少的循环数，避免 PCR 扩增中文库出现错误。 5） 验证文库：利用 Pico green 和荧光分光光度计（Quantifluor-ST fluorometer, Promega, E6090; Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit, Invi
7、trogen, P7589）方法定量文库； 并使用安捷伦 （Agilent） 2100 （Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent, 2100; Agilent High Sensitivity DNA Kit, Agilent, 5067-4626）对 PCR 富集片段进行质量控制，验证DNA 文库的片段大小及分布。 6） 均一化并混合文库： 多样品 DNA 文库 （Multiplexed DNA libraries） 均一化至 10nM 后等体积混合。 7） 上机测序：将混合好的文库（10 nM）逐步稀释定量至 4-5 pM 后进行上机测序。 （3）原始数据整理、
8、过滤及质量评估 以 Illumina MiSeq 平台测序为例： 先进行原始双端序列的过滤和连接： 测序得到的原始数据以双端（Paired-end） FASTQ 格式保存（R1.fastq 和 R2.fastq，Read1 和 Read2 序列一一对应） ，并采用以下步骤进行过滤：首先，采用滑动窗口法对双端的 FASTQ 序列做质量过滤：窗口大小为 10 bp，步长为 1 bp，从第一个碱基位置开始移动，要求窗口中碱基平均质量 Q20（即碱基准确率 99%） ， 从第一个低于 Q20 处截断序列， 最终要求序列长度 150 bp， 且不容许有 N （模糊碱基） ； 随后， 利用 FLASH软件
9、（v1.2.7，http:/ccb.jhu.edu/software/FLASH/）(Magoc and Salzberg, 2011)，对通过质量初筛的双端序列根据重叠碱基进行配对连接：要求 Read 1 和 Read 2 两条序列的重叠碱基长度 10 bp，且不允许碱基错配。最后，根据每个样本所对应的 Index 信息（即 Barcode 序列，为序列起始处用于识别样本的一小段碱基序列） ，将连接后的序列识别分配入对应样本（要求 Index 序列完全匹配） ，从而获得每个样本的有效序列。 再获取优质序列： 首先运用 QIIME 软件（Quantitative Insights Into M
10、icrobial Ecology，v1.8.0，http:/qiime.org/）(Caporaso et al., 2010)识别疑问序列。除了要求序列长度 150 bp，且不允许存在模糊碱基 N 之外，我们还将剔除：1) 5 端引物错配碱基数 1 的序列； 2) 含有连续相同碱基数8 的序列。随后，通过 QIIME 软件（v1.8.0，http:/qiime.org/）调用USEARCH（v5.2.236, http:/ （4）OTU 划分和分类地位鉴定 在微生物生态学领域，OTU（Operational Taxonomic Unit，可操作分类单元）(Blaxter et al., 20
11、05)通常是指根据某一人为设定的序列相似度阈值，将来自一个或多个样本的序列进行归并，彼此间相似度高于该阈值的序列都将归并为一个 OTU。通过序列归并和 OTU 划分（Demarcation） ，不仅可以简化数据结构，也更有利于在某一确定的分类水平，对不同来源的微生物群落样本进行互相比较。目前大多数基于 16S rRNA 基因的菌群结构多样性研究中，通常都以 97%的序列相似度作为 OTU 划分阈值，该阈值大致相当于分类学中物种（Species）水平的序列差异。 首先使用 QIIME 软件， 调用 UCLUST 这一序列比对工具(Edgar, 2010)，对前述获得的序列按 97%的序列相似度进
12、行归并和 OTU 划分，并选取每个 OTU 中丰度最高的序列作为该OTU 的代表序列。随后，根据每个 OTU 在每个样本中所包含的序列数，构建 OTU 在各样本中丰度的矩阵文件（即 OTU table） 。 对于每个 OTU 的代表序列，在 QIIME 软件中使用默认参数，通过将 OTU 代表序列与对应数据库的模板序列相比对，获取每个 OTU 所对应的分类学信息。对于不同类别的序列，分别采用各自特定的数据库作为 OTU 分类地位鉴定的模板序列： a) 针对细菌和古菌的 16S rRNA 基因数据库： 默认采用 Greengenes 数据库 （Release 13.8， http:/ et al
13、., 2006)，也可按需选择 RDP（Ribosomal Database Project）数据库（Release 11.1，http:/rdp.cme.msu.edu/ ）(Cole et al., 2009) 或 Silva 数据库（Release115，http:/www.arb-silva.de）(Quast et al., 2013)； b) 针对真菌的 18S rRNA 基因数据库： 采用 Silva 数据库； （Release115，http:/www.arb-silva.de）(Quast et al., 2013)； c) 针对真菌的 ITS 序列的数据库： 采用 UNIT
14、E 数据库（Release 5.0，https:/unite.ut.ee/）(Koljalg et al., 2013)。 （5）Alpha 多样性分析 1）Rarefaction 稀疏曲线 获得 OTU 丰度矩阵之后，可以进行一系列的分析，比如计算每个样本群落的多样性（即Alpha 多样性） 。首先，可以绘制稀疏曲线（Rarefaction curve） ，以此评判每个样本的当前测序深度是否足以反映该群落样本所包含的微生物多样性。 稀疏曲线是生态学领域的一种常用方法， 通过从每个样本中随机抽取一定数量的序列 （即在不超过现有样本测序量的某个深度下进行重抽样） ，可以预测样本在一系列给定的测序
15、深度下，所可能包含的物种总数及其中每个物种的相对丰度(Heck et al., 1975; Kemp and Aller, 2004)。因此，通过绘制稀疏曲线，还可以在相同的测序深度下，比较不同样本中 OTU 数的多少，从而在一定程度上衡量每个样本的多样性高低。 使用 QIIME 软件， 对 OTU 丰度矩阵中每个样本的序列总数在不同深度下随机抽样， 以每个深度下抽取到的序列数及其对应的 OTU 数绘制稀疏曲线。 2）Specaccum 物种累积曲线 物种累积曲线（Species accumulation curves）与稀疏曲线类似，用于衡量和预测群落中物种丰富度随样本量扩大而增加的幅度，
16、被广泛用于判断样本量是否足够并估计群落丰富度(Chao and Shen, 2004)。通过物种累积曲线，不仅可以估计样本量是否足以反映不同群落间的多样性差异，在样本量足够多的前提下，也可以大致估计群落多样性的上限（一般在样本量 10 个时进行分析） 。 使用 R 软件，对 OTU 丰度矩阵中每个样本所对应的 OTU 总数绘制 Specaccum 物种累积曲线。 3）丰度等级曲线 与稀疏曲线不同，丰度等级曲线（Rank abundance curve）将每个样本中的 OTU 按其丰度大小沿横坐标依次排列， 并以各自的丰度值为纵坐标， 用折线或曲线将各 OTU 互相连接，从而反映各样本中OTU丰度的分布规律（详见https:/en.wikipedia.org/wiki/Rank_abundan
