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1、ICS65.020.30 B44中中 国国 实实 验验 动动 物物 学学 会会 团团 体体 标标 准准T/CALAS x-201x实 验 动 物转 基 因 鸡 模 型 血 液 基因 组 DNA 提 取 和 纯 化 方 法Laboratory animal Detection method of transgenic chicken modelsDNA in blood extraction and purification（征求意见稿）201x-xx-xx发布201x-xx-xx实施中国实验动物学会 发布前言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则编写。本标准由中国实验动物学会归口。
2、本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人：孟庆文、王伟、陈洪岩。实验动物实验动物 转基因鸡模型血液基因组转基因鸡模型血液基因组 DNA 提取和纯化提取和纯化方法方法1 范围本标准规定了转基因鸡模型血液中 DNA 提取和纯化的方法和技术要求。 本标准适用于转基因鸡模型血液中 DNA 的提取和纯化。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适 用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（
3、包括所得的修改单）适用于本文件。 农业部 2406 号公告-7-2016 转基因动物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 GB/T 19495.1-2004 转基因产品检测 通用要求和定义 GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 19495.3-2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T 19495.7-2004 转基因产品检测 抽样和制样方法 NY/T 674-2003 转基因植物及其产品检测 DNA 提取和纯化3 原理通过物理和化学方法使 DNA 从转基因鸡实验动物模型血液样品中分离出来。利用不同 的纯化方法，弃处样品中的蛋白质、脂肪、多糖和
4、其他次生代谢物，以及 DNA 提取过程中 加入的氯仿、异戊醇等化合物，获得纯化的 DNA。4 主要试剂与材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸水或符合 GB/T 6682 二级水要求的水。 4.1异戊醇（C5H12O） 4.2氯仿（CHCL3） 4.3乙醇（C2H5OH） ，体积分数为 95% 4.4二水乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA2H2O，C10H14N2O8Na22H2O） 4.5十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa，SDS） 4.6盐酸（HCL） ，体积分数为 37% 4.7异丙醇CH3CH(OH)CH3 4.8蛋白酶 K（20U/mg） 4.9乙酸甲（KAc） 4.10氯化钠
5、（NaCl） 4.11氢氧化钠（NAOH） 4.12三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris） 4.13磷酸氢二钠（Na2HPO4） 4.14磷酸二氢钾（KH2PO4） 4.15甲醛（HCHO） ，体积分数为 35%-40% 4.16聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-x100） 4.1710 mol/L 氢氧化钠溶液：在 160mL 水中加入 80.0g 氢氧化钠（NaOH） ，溶解后再加 水定容至 200mL。 4.180.5mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液 （pH8.0） ： 称取 18.6g 乙二胺四乙酸二钠 （EDTA-Na2） ，加入 70mL 水中，再加入适量氢氧化钠溶液，加热
6、至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠 溶液（4.17）调 pH 至 8.0，加水定容至 100mL。在 103.4kPa（121）条件下灭菌 20min。 4.191 mol/ L 三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（pH 8.0） ：称取 121. 1 g 三羟甲基氨基甲烷 （Tris） 溶解于 800 mL 水中， 用盐酸 （HCl） 调 pH 至 8.0， 加水定容至 1000 mL。 在 103.4 kPa （121）条件下灭菌 20min。 4.205 mol/ L 氯化钠溶液：称取 29. 22 g 氯化钠（NaCl）溶于 80 mL 水中，加水定容至 100 mL。在 103. 4 kPa
7、 蒸汽压（121 ）条件下灭菌 20 min。 4.213 mol/ L 乙酸钾溶液（pH 4.8） ：称取 29. 43 g 乙酸钾（KAc）溶于 60 mL 水，用冰乙 酸（HAc）调 pH 至 4.8.加水定容至 100mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20min。 4.22DNA 提取细胞裂解液：在约 700mL 水中，依次加入 10mL 乙二胺四乙酸二钠溶液 （4.18） ，20mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（4.19） ，80mL 氯化钠溶液（4.20） 。另称取 10g 十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa，SDS） ，混合后加热至完全溶解后冷却至室温，用水定
8、容只 1000mL，室温保存备用。 4.2320mg/mL 蛋白酶 K 溶液；将 200mg 蛋白酶 K（Proteinase K）溶于 9.5mL 水中，轻摇 至完全溶解后，加水定容至 10mL。于-20保存备用。 4.24Tris-饱和酚。 4.25氯仿/异戊醇（24：1） ：将氯仿和异戊醇按照 24：1 的比例配制。 4.26TE 缓冲液（pH 8.0） ：在约 800mL 水中，依次加入 10mL 三羟基氨基甲烷盐酸溶液 （4.19）和 2mL 乙二胺四乙酸钠溶液（4.18） ，用盐酸（HCl）加水定容至 1000mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20min。 4.27
9、磷酸缓冲液（PBS） ：分别称取 NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g， 将各种物质溶解于 200mL 灭菌蒸馏水中，用盐酸溶液调 pH 至 7.4，加灭菌蒸馏水定容体积 至 1L，室温保存备用。 4.28体细胞固定液：两区 35%40%甲醛 9.4mL，加水定容至 1000mL，室温保存备用。 4.29乳化剂： 量取 20mL90%的聚乙二醇辛基苯基醚 （Triton-X100） ， 125mL95%乙醇， 855mL 浓度为 0.9g/L 的 NaCl 溶液，混合均匀，室温保存备用。5主要仪器和设备5.1分析天平：感量 0.1mg。 5.2
10、高速冷冻离心机。 5.3高速台式离心机 5.4紫外分光光度计。 5.5磁力搅拌器。 5.6高压灭菌锅。 5.7恒温水浴摇床。 5.8凝胶成像系统或照相系统。6操作步骤6.1 试样的制备 血液样品：取 5 mL，-20保存备用。 6.2 试样的预处理 待检测的鸡血液样品可直接用于 DNA 的提取。 6. 3 DNA 的提取与纯化 液态试样经预处理并充分混匀后，取 2 份相同的测试样进行 DNA 提取和纯化。每份测试样 20L。应根据试样质量的改变，按比例改变 DNA 提取与纯化过程中溶液和试剂的用 量。在试样 DNA 提取和纯化的同时，应设置空白对照。 a） SDS 法：适用于一般动物组织测试样
11、品 DNA 提取和纯化，如肌肉组织、血液、皮 肤、内脏、细胞培养物及加工产品等（见 A.1） ； b） 试剂盒法：经验证适合转基因鸡血液 DNA 提取和纯化的试剂盒，按照试剂盒说明 进行。 6.4DNA 的浓度和质量分析测定 测定并记录 DNA 在 260nm 和 280nm 的吸光度，将 DNA 适当稀释或浓缩，使其 OD260 值在 0.10.8 的区间内。以 1 个 OD260值相当于 50mg/L DNA 浓度来计算纯化 DNA 的浓度， 并进行 DNA 凝胶电泳检测 DNA 完整性。DNA 溶液 OD260/OD280值应在 1.8-2.0 之间，或质 量能符合检测要求。 6.5DN
12、A 溶液的稀释和保存 依据测得的浓度将 DNA 溶液用 0.1TE 溶液或水稀释到 25mg/L-50mg/L，分装成多管， -20保存。需要使用时，取出溶化后立即使用。附录 A (规范性附录) DNA 提取与纯化方法A.1 SDS 法A.1.1 范围 应用于实验室常规 DNA 制备。适用于一般动物组织测试样品 DNA 提取和纯化，如肌 肉组织、血液、皮肤、内脏、细胞培养物及加工产品等。 A. 1. 2 试剂和材料 主要试剂见 4.1-4.14，溶液配置见 4.17-4.27。 A.1.3 操作步骤 A.1.3.1 称取 0.05 g 待测样品(依试样的不同，可适当增加待测样品量，并在提取过程
13、中相应 增加试剂及溶液用量)，组织块剪碎或在液氮中充分研磨成粉末后转移至离心管中(不需研磨 的试样直接加入)。血液样品量取 350L，鸡血液样品量取 20L，转移至离心管中。细胞培 养物在常温下，1000 g 离心 10 min，弃去上清液。 A.1.3.2 向样品中加人 700L 细胞裂解液(血液样品加入 350L，鸡血液样品加入 20L)，然 后加入 30L 的蛋白酶 K 溶液，混匀，55消化 3h5h 至无明显组织块。 A.1.3.3 向消化后的裂解液中加人 70L 乙酸钾溶液，混匀冰浴 5 min-10 min，4，12 000 g 离心 10min，取上清液转移至新的 1. 5 mL
14、 离心管。 A.1.3.4 加入等体积的 Tris-饱和酚，缓慢颠倒混匀 10 min， 4，12 000 g 离心 10 min，取 上清液移至新的 1.5 mL 离心管中。 A.1.3.5 加入 0.5 倍体积的 Tris-饱和酚和 0.5 倍体积的氯仿-异戊醇(24：1)，缓慢颠倒混匀 10min，4，12 000 g 离心 10 min。 A.1.3.6 取上清液移至新的 1.5 mL 离心管中，加人等体积的氯仿-异戊醇(24：1)，缓慢颠倒 混匀 10min，4，12 000 g 离心 5 min。 A.1.3.7 多次重复操作步骤 A.1.3.6，直到两相中间不能看到明显的变性蛋白质为止，取上清 液移至新的 1.5 mL 离心管中。 A.1.3.8 加 2 倍体积-20预冷的无水乙醇，轻轻摇晃至絮状沉淀析出，12 000 g 离心 5 min-10min，倒掉上清液。 A.1.3.9 加 600L70%乙醇洗涤沉淀， 12000g 离心 3 min， 吸去上清液。 重复本步骤 1 次-2 次。 A.1.3.10 室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入 50L TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀。-20保存 DNA 溶液。
