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1、 动物总动物总 RNARNA 快速提取试剂盒（离心柱型）快速提取试剂盒（离心柱型） G GK K3015 3015 2 25 5 次反应次反应 G GK K3016 53016 50 0 次反应次反应 一一. . 试剂盒组成试剂盒组成 Components GK3015 GK3016 RnaEx TM(Trizol) a 30ml 60ml GenClean b column 25 2x25 2.0-ml Collection Tube 25 2x25 1.5-ml Collection Tube (RNase free) 25 2x25 Buffer RWA 40ml 2x40ml DEPC
2、-H2O 2x2ml 3x2ml Protocol 1 copy 1copy 用户自备试剂、材料：用户自备试剂、材料： 氯仿、异戊醇、无水乙醇、Tips（RNase-free） 二二. . 注意事项注意事项 1. RnaExTM为强腐蚀性物质，请勿接触皮肤衣物等，如不小心接触皮肤请立即用大量水冲洗，或就医。该试剂独立包装，收到后小心存放于 4。 2. Buffer RWA 中已含有乙醇，使用完后及时盖好盖子，以避免 RNase 污染和乙醇蒸发。 3. 试剂盒中的 GenClean 柱和 2ml、1.5ml 收集管已经过 DEPC 和高温高压蒸汽灭菌处理。柱、收集管可以重复进行 DEPC 处理和
3、高温高压蒸汽灭菌处理，烘干温度为 90左右。 三三. . 基本原理基本原理 研究基因的表达和调控需要从组织或细胞中分离纯化 RNA。RNA 质量的高低常常决定 cDNA 构建，RT-PCR 和 Northern Blot 等分子生物学实验的成败。RnaExTM是一种新型总 RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。Genclean 柱中的膜能选择性的与 RNA 结合，而蛋白等杂质不能结合，结合的 DNA 和其它杂质用 Buffer RWA 洗去。结合在膜上的 RNA 经 DEPC-H2O 洗脱，可用于各种分子生物学实验。 四四. . 产品产品特点特点 1.
4、 高纯度溶液和纯化系统保护 RNA 在提取过程中不被降解； 2. 漂洗液Buffer RWA 已经直接加好乙醇，便于客户使用。 3. 小份包装的试剂方便使用，并且可有效减少 RNase的污染。 4. 采用柱纯化方式，不需要异丙醇沉淀过程，方便快捷，实验成功率高。 五五. . 准备工作准备工作 RNA 酶(RNase) 是导致 RNA 降解最主要的物质，非常稳定。在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使 RNase 完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，进行与 RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴一次性干净手套；使用 RNA 操作
5、专用试验台；操作过程中避免讲话等等。 RNARNA 实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。 塑料制品、玻璃和金属物品的处理塑料制品、玻璃和金属物品的处理 1) 塑料制品：尽可能使用一次性无菌塑料制品。已标明 RNase-free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没必要再处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理后方可使用。处理方法如下： 在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC 使其终浓度为 0.1%。注意：DEPC 为活性很强的剧毒物，须在通风柜中小心使用。将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入 DEPC 水溶液，使塑料制品的所
6、有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中 37或室温下处理过夜。将 DEPC 水溶液小心倒入废液瓶中，将装有 DEPC 水处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少 30 分钟。灭菌塑料制品在合适的温度(80)下烘烤干燥。置洁净处备用。 2) 玻璃和金属物品 250烘烤 3 小时以上。 3) RNase 的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用 DEPC 配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。 六六. . 实验操作步骤：实验操作步骤： 1. 在液氮中将组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到 1.5ml 离心管中。每 50mg
7、动物组织或 1x107个细胞加 1ml的 RnaEXTM。 2. 加入 RnaEXTM的样品漩涡震荡 30 秒或用力摇动 10次，然后 15-30静止 5分钟，以充分裂解样品。 3. 按照每 1ml的 RnaEXTM加入 200ul 氯仿，剧烈振荡混匀 30秒，然后室温放置 35分钟。 4. 台式离心机上，12,000rpm，4离心 510 分钟，溶液充分分层。 5. 取 450500ul 上清液小心转移到无菌 1.5ml RNase-free（需客户自备）离心管里，加入 200ul 无水乙醇，混匀（此处可能会出现絮状沉淀物）。 注：上清水相共有约注：上清水相共有约 550ul，在吸取上清水相
8、时，一定注意不要吸到中间层和下层有机相，也不要试图，在吸取上清水相时，一定注意不要吸到中间层和下层有机相，也不要试图吸取过多的水相，以免吸取过多的水相，以免 DNA 等其他杂质污染。等其他杂质污染。 此处也可以直接将约此处也可以直接将约 500ul 的上清吸到离心柱中，然后在向离心柱中加入的上清吸到离心柱中，然后在向离心柱中加入 200ul 无水乙醇，并混匀。无水乙醇，并混匀。 6. 将上述溶液全部（包括沉淀）转移到套放于 2ml 收集管内的 GenClean 柱中，室温放置 2 分钟， 8,000rpm 离心 1 分钟。 7. 小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，加入 60
9、0ul buffer RWA，8,000rpm，室温离心 30秒，弃去收集管中的废液。 8. 重复步骤 7 一次。 9. 小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，12,000rpm，室温离心 1 分钟。 10. 小心取出柱子，放入无菌 RNase-free的 1.5ml 离心管里（试剂盒自带），在柱内膜的中央小心加入50100l DEPC-H2O，5580放置 2分钟。 11. 12,000rpm，室温离心 1 分钟。收集管内的溶液为 RNA 样品，可立即使用或者-70保存。 12. RNA 的分析和定量： a) 测定样品在 260nm 和 280nm 的吸收值确定 RNA 的质
10、量。按 1OD260=40mg RNA 计算 RNA 的产率；OD260/280在 1.8-2.1视为抽提的 RNA 纯度很高。 b) 进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定抽提 RNA 的完整性和 DNA的污染情况。 七七. . 问题指南问题指南 1. 使用本试剂对不同组织材料提取的使用本试剂对不同组织材料提取的 RNA 量有何不同？量有何不同？ 一般情况下每克的组织或 1106个细胞中所能提取的 RNA 量如下表： 组织材料 起始样品量 Total RNA 提取量 肝脏 1g 约 5000g HL-60 培养细胞 1107个 约 100g 肾脏 1g 约 3000g 骨骼肌 1g 约 1500g 脑
11、 1g 约 1500g 2. 通过在不同波长下的吸光度，如何评价通过在不同波长下的吸光度，如何评价 RNA 质量质量? 有关 RNA 的吸光度说明如下： 260nm、320nm、230nm、280nm 下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。 OD260/OD280（R）体现了 RNA 中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的 RNA的 R值应在 1.82.0 之间，当 R 2.2 时，说明RNA 已经被水解成了单核苷酸。在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用 TE Buffer。 3. 如如何计算何计算 RNA 的浓度的浓度? RNA 浓度 =
12、（OD260-OD320)稀释倍数0.04 g/l。 4. 提取的提取的 RNA 中含有多糖怎么办中含有多糖怎么办? 大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖，其理化学性质与 RNA 十分接近，因此很难将其从 RNA中除去，使用此类组织材料提取 RNA 时，建议增加 RnaEx TM的使用量。 5. RNA 提取量较低怎么办提取量较低怎么办? 向组织材料中加入 RnaEx TM后，请充分研磨匀浆使其充分裂解。 相分离后请尽量完全回收上清液。 6. OD260/OD280 值值1.65，为什么，为什么? RNA 应使用 TE Buffer 稀释后再进行吸光度值的测定，低离子强度或低 pH值会使
13、 OD280 值升高。 样品裂解时加入的 RnaEx TM量偏少，造成蛋白变性不充分。 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足 5 分钟。 相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。 7. 提取的提取的 RNA 降解，为什么降解，为什么? 使用的组织材料不够新鲜。提取 RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80保存。 提取 RNA 时使用的试剂及器材中有 RNA 分解酶污染。 提取的组织材料中含有大量的 RNA 分解酶，而 RnaEx TM的添加量不够。 8. 提取的提取的 RNA 中含有中含有 DNA 污染，为什么污染，为什么? 裂解组织或细胞使用的 RnaEx TM量偏少。 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等)、高浓度的 Buffer、碱性溶剂等。 如果提取的 RNA 中含有 DNA 时，可以使用 DNase I进行 DNA 消化。 八八 储存储存 4OC 冷藏保存，保质期为一年。 Product Use Limitation: This product is developed, designed and sold exclusively for research purpose and in vitro use only.
