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1、中国组织工程研 究第 仃 誊 5 3 2 0 1 31 23 1出版 Ch i n es e J o u r n a l o f T i s s u e Eng in ee r i n g Re s e a r c h De c e mb e r 31 ，2 01 3 V o L 1 7 , No 5 3 一cR矾。 d o i ： 1 0 3 9 6 9 i s s n 2 0 9 5 4 3 4 4 2 0 1 3 5 3 0 0 5 h t t p ： ww w c r t e r , o r g 李云秀孙莹璞啻莉马艳薄 不同冷冻方案保存人类鄂巢组织的活性比较 中匡组织I程研究。 2 0
2、 1 3 ，1 7 ( 5 3 ) ： 9 1 2 5 - 9 1 3 1 不同冷冻方案保存人类卵巢组织的活性比 较术 李云秀 2 孙莹璞 ，唐莉 ，马艳萍 ( 郑州大学第一附属医院生殖中心，河南省郑州市4 5 0 0 5 2 ； 云南省第一人民医院生殖遗传科， 云南省 昆明市6 5 0 0 3 2 ) 文 章 亮点 ： 1卵巢组织冷冻保存被认为是保存女性生殖 内分泌功能安全、有效的方法 ，但 目前仍没有建立一种统一、 稳定的卵巢组织冷冻方案。 2 文章采用程序冷冻法和 2种玻璃化冷冻方法对 2 O例人类卵巢组织进行冷冻保存， 评价 3 种冷冻方法保 存卵巢组织活性的效果。结果显示，液氮直投法
3、冷冻保存效果稳定，与程序冷冻法相似，但操作简便，只需 置入冷冻保护剂内，4平衡 6 mi n即可投入液氮内保存。实验降低了液氮直投法主要冷冻保护剂乙二醇的 浓度，与文献 比较 ，冷冻效果并未明显降低 。 3文章的不足之处在于观察时间较短，未观察到冷冻卵巢组织卵泡长期存活及进一步发育隋况。卵巢组 织体外培养 目前仅能发育到次级 卵泡阶段，卵泡在体外的成熟发育还有待更深入研究。 关 键 词 ： 器官移植：组织移植；人卵巢组织；程序冷冻法；玻璃化冷冻；细胞存活， 死亡分析；体外培养；卵泡活性； 省级基金 主题 词 ： 卵巢；低温保存；细胞存活；细胞死亡；卵泡 基金资助： 云南省国际技合作暨科技兴贸专
4、项计划项 目( 2 0 0 6 GH1 7 ) 摘要 背景：卵巢组织冷冻保存被认为是保存女性生殖内分泌功能安全、有效的方法，但 目前 尚无统一确定的方案。 目的：探讨 3种冷冻方案对人类卵巢组织保存冷冻效果及卵泡活性的影响。 方法：采用丙二醇慢速程序冷冻法 、 二 甲基亚砜玻璃化冷冻法、液氮直投法对 2 O例人类卵巢组织进行冷冻保 存，复苏后采用细胞存活， 死亡荧光分析法计数有活性的细胞，体外培养测定培养液雌二醇浓度及各级卵泡计 数，判断 3种不同冷冻方案对人类卵巢组织活性的影响。 结果与结论 ： 不同冷冻方案冻融后 卵巢组织块的活性卵泡率均低于新鲜卵巢组( 尸 5 0 活颗粒细胞、活卵母细胞
5、+ 5 0 活颗粒细胞 及死卵母细胞，前2 种均视为存活 的卵母细胞。本实验 中对卵母细胞的核是红色或只要周围颗粒细胞显示有 红色的卵泡均视为无活力，所 以检测 出的卵泡存活率 较 低 。 解冻后卵巢组织 内存活 的始基卵泡数量决定了可 进入生长卵泡阶段的卵泡数量，所以本实验通比较培养 前后生长卵泡百分 比的改变及雌激素的测定来评价冷 冻复苏后卵巢组织的活性。体外培养一方面可反映出解 冻后卵泡生长能力，另一方面也可间接反映出冷冻过程 对复苏卵泡的损伤程度。本实验中培养1 4 d 组织学观 察，各组卵巢组织内生长期卵泡比例增多，始基卵泡仍 然 占最主要的。新鲜卵巢组织正常卵泡的总数高于冷冻 组，
6、 说明经冷冻保存后的卵泡有丢失。 任何一种冷冻方案 都需要冷冻保护剂具有高渗透率和低毒性的特点， 才能达 到最佳的冷冻保存效果。 各种冷冻保护剂中，二甲基亚砜 的渗透能力优于丙二醇和乙二醇， 但其毒性较其他冷冻保 9 1 2 9 李云秀 等_ 嘲冷冻力案保 存人类卵巢组织的活性比较 v I ， C R T E R0 r g 护剂大。 乙二醇毒性较小且细胞渗透性高于丙二醇，已成 功应用于人类卵母细胞和胚胎的玻璃化冷冻 3 4 】 。 为了提 高冷冻效果同时又降低冷冻液的毒性，一些研 究中将二 甲基 亚 砜 与 丙 二 醇 和 乙 二 醇 混 合 使 用 称 为 鸡 尾 酒 ( c o c k t
7、 a i I ) 混合方案。 。 。H a s h i mo t o 等 比较 了以乙二 醇为主要冷冻保护剂添加和不添加二甲基亚砜的两种 玻璃化冷冻方案的效果，显示不添加二甲基亚砜组对猕 猴卵巢组织窦前卵泡的完整性优于添加二甲基亚砜组。 I s a c h e n k o 等 采用 以4 0 乙二醇为基 本冷冻保 护剂 超 速冷冻法对人类卵巢组织进行冷冻，冻存组织中形态正 常的始基卵泡数量大于8 O ，本法操作简便，只需4 平衡6 mi n 后即可直接投入液氮罐，故也称液氮直投法。 作者参照该法对人类卵巢组织进行冷冻保存，但将乙二 醇的浓度降l tJ 3 0 ，以减少冷冻保护剂的细胞毒性， 结
8、果可保存卵巢组织有活性细胞数( 7 9 7 + 5 9 ) ，与丙 二醇慢速程序冷冻组相似 ，而优于二 甲基亚砜 玻璃化 冷 冻组，体外培养有相同的结果，说明采用3 0 乙二醇的 液氮直投法保存卵巢组织活性冷冻效果可靠，且降低了 细胞毒性 。 综上所述，卵巢组织能够很好的耐受冷冻损伤，通 过冷冻保存可以保存大部分卵泡活性。本实验中3 0 乙 二醇为基本冷冻保护剂的超速冷冻法( 液氮直投法) 操作 简便，并能够较好的保存卵巢组织的活性，但其冷冻效 果的可靠性和稳定性还需大样本研究。 衷心感谢原云南省第一人民医院生殖遗传科主任章 晓梅教授对课题设计实施的指导和极力支持。 者赢税 李云秀和唐莉负责实
9、验设计、 资料收集及实验 实施， 孙莹璞负责实验评估及文章审校， 马艳萍负责实验指导 及资料收集，李云秀成丈。实验采用盲法评估。 益埘 课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组 织直接或间接的经济或利益的赞助。 伦理要 实验方案获得云南省第一人民医院伦理委员会 批准，患者 自愿提供卵巢组织， 对 实验过程完全知情同意，并 签署 知情同意书。 ； 孝玻璃 化冷冻一“ 玻璃化” 的概念是指 水或溶液 快速降温达到或低于一 1 0 0 至一 1 1 O的温度范围时，形成 一种高黏度的介于液态和固态之间、 非晶体的、 透明的玻璃态。 慢速冷冻法在降温的冷冻过程中会形成冰晶， 从而造成胚胎的 伤害。 玻
10、璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂 溶液将细胞内水分换出来， 经急速降温由液态转化为外形似玻 璃状的非晶体化固体状态， 在无冰晶形成下保存，以减少细胞 内结冰造成伤害从而改善慢速冷冻的缺点， 提高冷冻保存的效 果 。 者 文章为原创作品， 数据准确， 内容不涉及泄密， 无一稿两投， 无抄袭， 无内容剽窃， 无作者署名争议， 无与他 人课题以及专利技术的争执，内容真实，丈责 自负。 91 3 0 4 参考文献R e f e r e n c e s 【 1 】 Ok t a y K ， B u y u k E Ov a r i a n t r a n s p l a n t a t i
11、 o n i n h u ma n s： i n dic at i o ns， t ec h niqu es a nd t h e r is k o f r e s e ed i n g c an c er Eu r Ob s t e t Gy n e c o l Re p r o d Bio 1 2 0 0 4 ； 1 1 3 S u p p l 1 】 ： $4 5 - 4 7 【 2 】 An d e r s o n RA， Wa ll a c e WH， B a ir d D T Ov a r ia n c r y opr es er v at i o n f or f e r t i
12、 l it y p r e s er v a t ion： i n dic a t i o n s a n d o u t c o me s Re p r o d u c t io n 2 0 0 8 ： 1 3 6 ( 6 ) ： 6 8 1 - 6 8 9 3 】3 J a k imi u k A J ， F r it z A E n d r y n o l P o 1 Ov a r i a n t i s s u e c r y opr es er v at i on a s a p er s p e c t i v e f or f er t i l it y p r e s erva
13、t i on E n d o k r y n o l P o 1 2 O 0 5 ： 5 6 ( 6 ) ： 9 9 8 - 1 0 0 1 4 】 J a k imi u k A J ， Gr z y b o ws k i W Ov a r ia n t is s u e p r e s e r v a t io n ， pr es e n t an d c l i nic al pe r s p ec t i v es Gyn e c ol En do cr in o1 2 00 7； 2 3 ( 2 ) ： 8 7 - 9 3 【 5 】5 Do n n e z J ， Do l ma
14、n s MM Cr y o p r e s e r v a t io n a n d t r an s p l an t a t ion o f ov a r ian t i s s u e Cli n Ob s t et Gy n e c o1 2 01 0； 5 3 ( 4 ) ： 7 8 7 7 9 6 【 6 】 陈乐真 妇产科诊断病理学【 M】 第2 版 ，北京 ：人 民军医 出版社 社 ，2 0 1 0 7 】7 Co o k DA， E d g a r DH，S t e r n C E ff e c t o f c o o li n g r a t e a n d deh y d
15、r a t ion r e gi men on his t ol o gic al a p pe ar an c e o f hu man ov a r ian co rte x f o l l o wi n g c r y op r es erva t i o n i n PROHHu m R e p r o d 1 9 9 9 ； 1 4( 8 ) ： 2 0 6 1 2 0 6 8 【 8 】8 H a s e g a wa A， H a ma md a Me h a n d j ie v e t a 1 I n v it r o g r o wt h an d mat ur a t i o n a s we l l as f ert i l iz at i on o f mo u s e pr ea n t r al o o c y t e s f r 0 m v i t r if ie d o v a r i e s F e rt i l S t e r i l 2 0 0 4 ； 8 1 ( Su p p l 1 ) ： 8 2 4 83 0 【 9 】 I s
