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1、第 2 7卷 2 O1 3年 第 6期 1 2月 长 治 医学院学 报 J OURNAL OF CHANGZHI MEDI CAL COLLEGE Vo I 2 7 No 6 D e c 2 0 1 3 4 01 基 础研 究 I GF 一 1基因转染对大鼠成肌细胞增殖和分化的影响 王晓林 王庸晋 荣书玲 马红彪 摘 要 目的： 探讨人类胰岛素样生长因子一 1 ( h l G F _ 1 ) 基因转染对骨骼肌成肌细胞增殖和分化的作用及机 制 。方 法： 分剐用 p L g h l G F - 1 S N 质粒和对照质粒 p L g G F P S N 转染成肌细胞作 为 I G F组和 G F
2、 P组 ， 未转染成肌 细胞作为细胞对照( C o n t r o 1 ) 组。转染后用免 疫细胞化 学、 R T _ P C R检测 h l GF - 1基 因在成肌细胞 中的表达。 MTT方法检测成肌 细胞增殖能力 ， 流式细胞仪检测成肌 细胞 的细胞 周期 变化 。通过检 测细胞 融合 率与磷 酸肌 酸激酶( C K ) 含量检 测 I G F - 1 基 因转染对成肌 细胞分化 的影响 。结果 ： 基 因转染后免 疫细胞 化 学和 R T - P C R 检 测发现 I G F组细胞有 h l G F - 1 表达， G F P组和 Con t r o l 组细胞未见 h I G F
3、- 1 表达； M 兀、 检测显示I G F组成肌细胞 光吸收值增大， 与 Con t r o l 组和 G F P组细胞相比， 差异有显著性( P0 0 5 ) ， 第 2 7天与 GF P组 合 C o n t r o l 组 比 较， 差异均有显著性(P d0 0 5 ) ， 说明 I G F 一 1 基 因 转染 后成 肌细 胞增殖 能力 增强 ， 见表 1 。 2 4 流式 细胞仪 检 测 h I GF 一 1基 因转 染对 成肌 细胞周期 的影 响 I GF组 、 对 照组 和 GF P组 细胞 G1期 比例 分 别为 2 3 7 、 6 3 7 和 6 6 5 ， S期 比例分
4、别为 6 3 1 、 2 6 7 和 2 4 5 ， 与 对 照 组 和 G F P组 相 比 ， I GF 组 G1期 细 胞 百 分 比 显 著 下 降 ( P 0 0 5 ) ， S期 细胞百 分 比则显 著增加 (P d0 0 5 ) 。 2 5 h I GF 一 1基 因转 染对 成肌 细胞 融合 率 的影 响 成肌细胞在含 1 0 mL L浓度 马血清 的高 糖 D ME M 培 养基 中培 养 ， 约 3 4 d后显 微 镜下 开始 观察到当原代细胞增殖至 7 o 汇合水平时 ， 相邻 成肌细胞靠拢， 整齐排列， 胞膜模糊， 融合形成肌小 管 。肌 小管 呈 长条 形 ， 粗 大
5、 ， 含 多 个 胞 核 。随着 时 间推移 ， 细胞 密度 变大 变长 ， 细胞 融合越 来越 多 ， 可 4 0 4 长治 医学 院学报 以见到许多有两个核 以上象 串珠 似的肌管 出现 ， I GF组原代成肌细胞融合在第 5天达峰值 ， 融合率 为 5 9 ， 与 C o n t r o l 和 GF P组 相 比显 著增 加 ， P 0 0 5 ( 见图 3 A) ， C o n t r o l 和 GF P组融合则在第 7 天达峰值， 融合率分别是 3 3 和 3 2 。 表 1 各 组不 同时间点 的吸光度值( S ， r =6 ) Ta b 1 Ef f e c t s o f
6、h l GF - I g e n e t r a n s f e c t i o n o n my o b l a s t s ( i S ， 一 6 ) P d 0 05( V S Cont r o 1 )， P d O 05( V S GFP) 2 6 h I GF - 1 基 因转染对成肌 细胞 C K合成 值， 分别是 2 4 0 0 m U mL和 2 3 0 0 mU m L ， I G F 的影 响 组与 C o n t r o l 和 GF P组相比显著增加(P d0 0 5 ， I GF组成肌细胞 C K合成于第 5天达峰值 ， 为 见 图 3 B ) 。 3 9 0 0 m
7、U mL， C o n t r o l 和 GF P组 于第 7天 达 峰 60 V 斛 锺 30 3 000 j 型 鎏1 5 o 0 0 0 5( v s C o n t r o 1 ) ， # 尸o 0 5( v s G F P ) 图3 A ：h I G F 一 1 基 因转染对成肌细胞融合率的影 响；B ：h I G F 一 1 基因转染对C K 合成的影 响 3 讨 论 骨骼 肌成肌 细胞 是骨骼 肌 的前体 细胞 ， 它具有 自体来 源 ， 取材 方便 ， 易于 在体外 扩增 ， 只 向肌纤维 细胞分 化 ， 对缺 血 耐受 力 大 ， 植 入 自体 不 引 起排 斥 反应 。成
8、 肌细胞 这 些 独特 的生 物 学特 性 使 其 成 为 基 因治疗 、 细胞 移植及 组织 工程 的理想 候选 细胞之 一l 】 。h I GF - 1是由肝脏合成和分泌的胰岛素 家族 的一 种多 肽 。它 在 细胞 的 分化 、 增 殖 、 个 体 的 生长发 育 中具有 重要 的促进 作用 。作 为刺激 因子 ， 具有促进细胞的有丝分裂 。抑制细胞的凋亡 ， 增强 机体免疫功能等生物活性_ 3 。我们 以前 的研究 表 明 ： h I G F 一 1 基 因体外 转 染成 肌 细胞 抑 制 了成肌 细胞的凋亡。本研究显示 ： h I GF 一 1基 因体外转染 成肌 细胞促 进 了成肌
9、细 胞 的增殖 和分化 。 首先我们用 MT T方法检测了 h I GF 一 1基因转 染对成肌细胞增殖 的作用 。MTT方法通过测定 光吸 收值 ， 可 以 问接 反 映 出 有 活 力 细 胞 的相 对 数 量 ， 从 而反 映细胞 增殖 能力 的变化 。本研 究结 果显 示 ： h I G F 一 1 基 因转 染后 ， 成 肌细 胞 的光 吸收值 与对 照组相比显著增加 ， 说明 h I G F 一 1 基 因转染成肌细 胞后 ， 显著增 加 了成肌 细胞 的增殖 能力 。 为了探讨 h I GF 一 1促进成肌细胞增殖的机制 ， 我们用流式细胞仪检测 了 h I G F 一 1基 因
10、转染对成 肌细 胞细胞 周期 的影 响 ， 观察 指标 是检 测某 时 间段 处于 不 同细胞 周 期 的细 胞 百 分 比。细胞 周期 中 S 期 的主要机 能 活动 为进 行 DNA 合 成 ， 通 过 检 测 S 期 细胞 的 百 分 比 ， 可 以检 测 细 胞 的 D NA 合 成 速 度 ， 从 而检 测细 胞 的增 殖情 况 。S期 细 胞 百分 比升 王晓林等 I GF 一 1 基 因转染对大 鼠成肌细胞增殖和分化的影响 4 05 高 ， 表 明细胞 的 D NA合 成增 高， 细 胞增殖 加速 。 本研 究结 果 显示 ， h I GF 一 1基 因转染 成 肌 细胞后 ，
11、流 式细胞仪检测显示对照组和 GF P组细胞 G1期 比 例分别为 6 3 7 和 6 6 5 ，而 I GF组细胞 G1期 比例为 2 3 7 ； 对照组和 GF P组细胞 s期 比例分 别 为 2 6 7 和 2 4 5 ， 而 I GF组 细胞 S期 比例 为 6 3 1 。与对 照组 和 G F P组 相 比 ， I G F组 G1期 细胞百分 比显 著下降 ， S期 细胞百分 比则显 著增 加， 表明基 因转染成肌细胞后可以合成和分泌具有 生物 活性 的 h I GF 一 1 ， h I GF 一 1在 成 肌 细 胞 的表 达 ， 促进了更多的成肌细胞进入 s期， 即进入 DNA合
12、 成期 ， 从 而导致 更 多 的 细 胞进 行 分 裂 和 增 殖 ， 表 现 为细 胞总 数增 加 。h I G F - 1 基 因转 染成 肌 细胞 后 S 期细胞百分比显著增加提示 I GF 一 1促增殖 的作用 主要 是通 过改 变细 胞周 期来 实现 的 。 在进 一 步的研 究 中 ， 我 们探 讨 了 h I GF 一 1基 因 转染 对成 肌 细 胞 分化 的影 响 。成 肌 细 胞 中的 C K- MM 可 以特异 性地 反 映 肌 细胞 的分 化 程 度 。我 们 通过检测 h I GF 一 1基 因转染 对成肌细胞 的融合率 及对 C K MM 合成 的作用 ， 检测
13、I G F - 1基 因转染 对成 肌 细 胞 诱 导 分 化 的影 响 。结 果 显 示 ： h I G F 一 1 基因转染成肌细胞后成肌细胞融合 率和 C K合成 显著增加 ， 分别是 5 9 和 3 9 0 0 mU mL， 于第 5 天达峰值 。对照组和 GF P组细胞成肌细胞融合率 和 C K合成分别是 3 3 、 3 2 和 2 4 0 0 i n U mL、 2 3 0 0 mU mL， 于第 7天达峰值 。h I GF 一 1基 因转染 显著地增加了成肌细胞的分化能力 ， 而且缩短了成 肌细胞的分化进程。有研究认为 I GF 一 1促进分化 是 由于 I GF - 1 增加了
14、成肌细胞的增殖能力 ， 使其早 期 、 大量 进 入分化 阶段 所致 3 。 总之， 用携带 h I GF 一 1基 因的重组逆转录病 毒 载体转染体外培养的成 肌细胞， 可 以实现 h I G F l 基 因在成 肌 细胞 中有 效 稳 定 地表 达 。h I GF I 基 因 在 成肌 细胞 的表 达 ， 显 著地 促进 了成 肌 细胞 的增殖 和 分化 。 这些结果为下一步将获得的稳定表达 h I GF 一 1 的成肌细胞植入体 内， 实施对组织器官的修复治疗 以及将成肌细胞用 于组织工程的研究提供了实验 依据 。 参考文献 1 1 R o n g S L ， L u Y X， L i
15、a o YH， a 1 E f f e t c s o f t r a n s p l a n t a t e d myo b l a s t s t r a n s f e c t e d wi t h h u m a n g r o wt h h o r mo n e g e n e o n i m p r o v e me n t o f Ve nt r i c u l a r f u n c t i o n o f r a t s Ch i n Me d J ， 2 0 0 8， 1 2 1 ( 4 )： 3 4 7 35 4 E 2 1 Ro n g S L， Wa n g Y J ， Wa n g X L， a 1 Re c o mb i n a n t p r o t e in s s e c r e t e d f r o m t i s s u e e n g i n e e r e d b i o a r t i f i e ia l mu s c l e i m p r o v e c a r d i a c d y s f u nc t ion a n d s u p p r e s s c a r d i o m y o c y t e
