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1、 培养基培养基1 1 富集培养基菌株的富集培养采用改良的牛肉膏蛋白胨培养基, 配方如下:牛肉膏1g.蛋白胨4g.CMC一Na 0.5 g.水1000mL, 用1m的NaOH 溶液调节pH 为7.2-7.4 .2 2 筛选培养基筛选培养基采用改良刚果红固体培养基, ,其具体配方如下: K2HPO4 0.5g, MgSO4 0.25g CMC-Na 2.0g ,刚果红0.2g 蛋白胨2.0g, 自然pH 加水定容至l00OmL 其中固体培养基琼脂含量为1.5% .3 3 摇瓶发酵培养基发酵培养基采用以C M C 一N a 为唯一碳源培养基, 具体配方如下: K2HPO4 0.5g, MgSO4 0
2、.25 g , CMC 一N a 1.0g , 酵母粉1.0g , 蛋白陈1.0g , 自然pH , 加水定容至1000mL.4 4 保藏培养基菌种保藏采用牛肉膏蛋白陈培养基: 牛肉膏3g ; 蛋白胨10g; 琼脂15g ;水1000m L , 其中固体培养基琼脂含量为1.5%.分子鉴定中菌体采用LB培养基:胰蛋白陈(Tryptone) 10g/L , 酵母提取物5g/L , 氯化钠(NaCl)5g/L , 用NaOH调节pH 为7.4.其中培养基中使用的试剂均为国产分析纯 实验方法实验方法 菌株分离 1 1 样品处理 称取采集样品5g.无菌操作加入到含45mL无菌生理盐水(0.58%w/v)
3、的三角瓶中,置于 摇床150r/min.培养lh.让样品与生理盐水充分混合.使微生物悬浮于生理盐水中.静 置15min.取上层悬浮液作为菌株分离的材料. 2 2 初筛 使用刚果红选择培养基进行菌种分离, 能够降解纤维素的菌落周围出现透明圈, 而透明圈形成的大小及速度,可大致反映其产酶能力的强弱.分别取5mL的上述样品悬 液无菌操作接种到含45mL富集培养液的三角瓶中35富集营养培养2d.分别稀释至 10一3倍, 吸取0.2mL涂布到刚果红培养基上分别于恒温箱内35和25培养, 定期观 察菌落和透明圈的产生 挑选菌落周围有明显透明圈的菌株进行下一步的复筛. 3 3 复筛 从初筛平板上挑选透明圈较
4、大的菌落于刚果红培养基上进行划线后同上条件进行培 养.后挑选单菌落划线至牛肉膏蛋白陈培养基上培养.然后从中挑选单菌落至刚果红 培养基上培养 对仍能产生透明圈的菌落进行单染色和革兰氏染色.用NikonE-60 微 分干涉显微镜观察其形态.反复上述实验.确保为单一菌种.为了提高筛选效率.采用测 量相对酶活的方法来评估纤维素酶的活性.即通过测量菌落周围透明圈的直径与培养 时间的比例来测量相对酶活 CMC酶相对活性A = d /t , 其中:A 为相对活性, d 为透 明圈直径. t为培养时间 观察初筛菌株不同培养条件下的相对酶活力, 筛选出易培养且 相对酶活力较大的菌株供下面试验, 对复筛菌株进行染
5、色, 采用NikonType950数码相机 成像系统拍摄照片 分离菌株的生理生化测定分离菌株的生理生化测定 M.R试验 V.P试验 淀粉水解试验 明胶水解试验 叫噪试验 H2S试验 硝酸还原试 验 卵磷脂水解试验 碳源利用试验和氮源利用试验等分离菌株生理生化特征的 检测参照 常见细菌系统鉴定手册 方法进行 试验采用细菌微量生化反应管进行菌种筛选方法菌种筛选方法将土壤稀释液接人液体液体培养基中, 摇瓶培养7d , 再将培养液稀释, 涂布于固体分离培养基平板上,培养3 s d 后, 挑选生长最好的单菌落菌株在营养培养基平板上分离、纯化, 获得纤维降解菌.采用刚果红平板法川进行进一步筛选, 37 恒
6、温培养3 4 d 葡萄箱标准曲线的确定分别取1 m g / L 葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于6 支试管中, 用蒸馏水调至1mL , 然后加人1.5mL DNS溶液, 摇匀后沸水浴5 min , 取出迅速冷却, 定溶到10 mL, 充分混匀.在540 nm波长下测定OD值, 以葡萄糖含t为横坐标, 以对应的OD值为纵坐标, 作标准 曲线 纤维索阵活的侧定方法纤维索阵活的侧定方法1 1、酶活力(CM Ca se )测定参照K.Horikoshi方法:发酵液经4000r/ min离心10min , 上清液作为粗酶液. 取O.ZmL稀释液加人试管中, 加人1.0mL I
7、% CM C-N a底物溶液, 40 水浴保温30 min , 加人DNS试剂1 mL.沸水浴5 min 冷却后加人4mL蒸馏水,振荡摇匀,在540 nm波长下, 用721型分光光度计测OD值.等量失活酶液同样处理做对照,以扣除酶液中的还原糖.在上述条件下, 每分钟水解底物产生1mol 还原糖(以葡萄糖计) 的酶t , 定义为一个酶活单位U.2 2、不同发酵时间的纤维素酶活力的测定: 在40 条件下, 将两种菌株分别接入发酵培养基中, 分别培养1 2、2 4、4 8 、7 2、9 6、1 2 0、1 4 4、1 6 8 h , 取少量发酵液离心测定酶 活。3 3、不同发酵时间的生物量测定: 在
8、40 , 将两种菌株分别接人发酵培养基中培养, 分别在1 2、24、48、72、9 6、1 2 o h 测定6 0 0 n m 的吸光度。4 4、不同p H 值条件下的纤维素酶酶活力测定5 5、不同温度的纤维素酶酶活力测定: 取少t 酶液测定在不同温度条件下的酶活, 温度分别为20 , 30 , 40,50 , 60 , 70 , 按常规方法测定酶活。6 6、发酵液还原性糖的测定: 取粗酶稀释液侧定还原性糖含量。7 7、蛋白含量和酶活力比活力的测定, 可溶性蛋白质含量测定: 采用Brad for d 的方法测定, 以标准牛血清蛋白溶液为标准蛋白. 酶的比活力(U / m g ) = 纤维素酶活
9、(U / m L) / 可溶性蛋白含量(m g / m l, )。 结果与分析结果与分析1 1刚果红培养鑫培养刚果红培养鑫培养3 3天后的结果天后的结果我们筛选了两株能产生较为明显透明圈的菌株, 且透明圈较大, 为2 号和6 号菌株, 透明圈直径R / 菌落直径D 的比值分别为1.8 5 和1.7 6 2( 见表1 ) , 因此我们主要以2 号菌和6 号 菌为研究对。2 2 所产生的纤维素醉的特性所产生的纤维素醉的特性1）发酵时间对踌活力的影响两种菌株的发酵产生的纤维素酶活力的变化趋势类似, 都是在。 24 h 内, 酶活力上升不快, 到48 h 时达到峰值, 分别达到0.5 8l U / m L、0.3 76 U / m L , 随着发醉的延续, 酶活力保持平稳或略有下降趋势.可能是因为当到48h时, 部分纤维素醉失活.因此我们采用两菌株发酵48 h 为后面试验都采用该发酵时间.
