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1、 # 老年心蝻m管蝻杂志 2 0l 4年 2月 第 l 6卷 第 2期C h in J( ； e r ia l r He a r t B r a i nVe s s e l D is F e b 2 01 4 。 1 6 N o 2 基 础 研 究 缺氧对磷脂酶 A2 和脂蛋 白相关磷脂酶 A2 及溶血磷脂酸的影响 李月春 ， 刘国荣， 闫洁， 王 宝军。 张京芬， 张晖， 崇奕， 庞江霞， 郝喜娃 摘要 ： 目的 观察慢性缺氧对 鬼血浆 中磷脂酶 A ! ( P I A 2 ) 、 脂蛋 白相 关 P I A ( I p P I A! ) 和溶血磷 脂酸( 1 P A) 水 平 及促动脉粥样
2、硬化的影响 。方 法 将 1 2只健康新 西兰白勉随机 分为正 常对照组 和慢 性缺 氧组( 建立慢性 缺氧 动 物模型 ) ， 每 组 6只 分 别在 实验 前 、 实验 第 4周 、 8周 和 1 2周 末取 外周 血 应 用 I S A 法 捡测 各组免 血 浆 中 P I A ! 、 L p P l A ?和 l P A水平， 并于 1 2周 末取 各纽 兔主动脉 弓和腹主动 脉进行超 声检测 和 HE染色， 观 察血管病 理 改变。结果 与正常对照组和 闰组 实验前比较 慢性缺氧组免 第 d 、 8和 1 2周末 ， 血浆 中P l A 、 I p - P I A 和 l P A 水
3、平不同程度增 高， 且在 1 2周时增 高最明显( P P I A 2 ) 是 P I A z家族 中的一员 ， 已获美 国食 晶与药物管理 局批准， 成为第一个脑卒 预警标记物 。I p P I A ： 通过裂解氧化磷脂酰胆碱水解氧化低密度脂蛋白， 从 生成溶血磷脂酰胍碱和氧化游离脂肪酸 。 。 。溶 巾华老年心腑f 舡 管瘸杂志 2 0l 4年 2月 第 l 6卷 第 2期( n J G e r la t r He a r l Br a in V e s s e l 1 ) s &b2 0 1 i ， V o l 1 6 No 2 血磷脂酰胆碱在溶血磷脂酶 D的作用下， 进一步生 成溶血磷
4、脂 酸( 1 y s o p h o s p h f I t i d i c a c i d ， L P A) 。L P A 在动脉粥样硬化斑块中大量累积 。越来越多的汪据 表明， 在动脉粥样硬化和 血栓形成中， l P A 可 以作 为重要危险因素 I 。 细胞学研究显示 ， 缺氧可引起 P I A 中各家族 活化水平不同的变化， 但 总体表 现为总 P I A 水平 增高 刚。动物实验研究显示 ， 慢性缺氧( 每 日 8 h ) 2 l d后 ， 大 鼠血浆 中 P I A 。 活 性增 加f 。 目前 ， 动 物 体 内缺氧对 L p I I A 及 L P A 是否产生影 响， 尚少
5、见报道 ， 且随着慢性缺 氧时问 的延长 ， 动物血浆 中 P I A：表达情况， 仍需进一步 了解 。因此 ， 本研究探 讨慢性缺氧对兔血浆 P I A 、 L p - P I A 和 I P A的影 响 ， 为缺 氧在 促 动脉 j 羊 j 样硬 化 的作用 ， 以期 提供 新 的 理 论基 础 。 l材料 与 方法 1 1 实验 分组 健康新 四兰 白兔 1 2只， 3 4月 龄 ， 平均体质量为 2 4 4 k g ， 由北京兴隆动物养殖厂 提供 。分 笼 喂养 ， 自由饮 水 ， 温度 控制 在 ( 2 0 2 ) C。 饲料配方 由北京科 奥协力饲料有限公 司提供 ， 基础 饲料成
6、分 ： 玉米 、 面粉、 麸皮、 鱼粉 、 酵母等， 每只进食 璇 】 4 0 g d ， 自由饮水 。适应性 喂养基 础饲料 7 d 后 ， 称重， 从空腹 白兔耳背正中取动脉血 5 m1 检测 总 P I A。 、 L p P I A 和 L P A 含量， 每项检测结果均 无异常增高者 ， 用于动物实验分组 。根据是否接受 缺氧 干预 条件 ， 将 1 2只 新西 兰 白兔 随 机 分 成 2组 ， 正常对照组和慢性缺氧组 ， 每组 6只。 1 2 主要仪器和试剂 全 自动组织脱水机 、 石蜡包 理 机 、 行 蜡 切 片 机 、 摊 片 机 、 烘 片 机 、 电热 恒 温 于燥 箱、
7、 AI ( ) KAa l 0彩色超声 诊断仪、 ( YMP US显微 镜 、 兔 I J I A。 、 L p f L A 、 L P A 定 量 检 测 试 剂 盒 ( E 1 I S A)美 罔 R D公 司 。 1 3 建 立慢性 缺 氧模 型 根 据 新 西 兰 白兔 对 缺 氧 的耐受 能 力 ， 参 照冯 学威等 ，J 常压 缺氧 动脉 模 型 ， 将 白兔造 模 时 问延 长 为 】 2 h ， 0 8 ： 0 0 2 0 ： 0 0 ； 缺 氧 箱与外界有缝隙相通 ， 可使缺氧箱内外压差保持在 0 1 5 0 mm Hg ( 1 mm Hg 一0 1 3 3 k P a )
8、。将 慢性 缺 氖组白兔 6只置于缺氧箱 内， 控制氧浓度在 1 O 1 5 。舱内预先放好足量钠石灰和氯石灰 ， 充分吸 收 C O。 和 水 蒸 汽 。 氧 浓 度 每 调 节 1次 约 2 5 rai n 。 实验中间喂水 】次 ， 约 1 0 mi n 。正常对照组 白兔吸 人 空气 ， 其 他饲 养条件 相 同 。 1 4 血液生化检测 2组兔分别在实验前、 实验第 4 、 第 8和第 1 2周末清晨空腹禁食 1 2 h ， 禁水 6 h ， 经 耳正 中动 脉 采 血 ， 留 取 血 标 本 5 ml ， 立 即离 心， 3 0 0 0 r rai n ， 1 0 mi n ， 取
9、血浆。采用 E I I s A法测 定 血浆 中总 P I A。 、 L p P I A： 和 I P A 水平 。 1 5 超 声检 查动 脉厚 度及 斑块 2组兔 在 1 2周 末 进行高分辨超声检查 ， 应用 g -t 本 AI ( ) KA公司超声 检测仪 ， 探头频率 5 1 2 MHz 。称霞 ， 将 新 西兰 白 兔 四肢固定 ， 经耳缘静脉 注射麻 醉药 2 O 乌拉 坦 ( 4 ml k g ) 麻醉后， 仰卧位固定于检查台上， 充分暴 露 颈部 和胸部 ， 从 颈 总 动脉 分 义 处 至腹 主 动 脉 分 叉 处 ， 逐步观察血管壁二维图像 ， 测量颈动脉及腹主动 脉 内
10、膜 中层 厚 度 ( I MT) 、 斑 块 的大 小 ， 记 录斑 块 部 位 ， 以可探测到最大斑块作为组织病理学取材的依 据 ， 部分结果与病理切片对照 。正常兔主动脉壁结 构表现为“ 双线征” ， 即两条平行的强 回声被一个低 回声区分隔， 测量两条线之问的距离即为 I MT。 1 6 H E染 色 观 察 主 动 脉 弓和 腹 主 动 脉 斑 块 超 声检查后 ， 将深麻 醉状态下的新 西兰白兔 仰卧位 固 定于解剖台上 ， 去除颈、 胸 、 腹部毛， 碘伏常规消毒皮 肤 3 次 ， 从 颈部 至下 腹 部 逐层 划 开皮 肤 直 至 入纵 隔 和腹腔 内 ， 从 主动脉 起 始部
11、至腹 主动 脉 分 叉处 的 血 管与周围组织剥离、 暴露， 并将主动脉从根部分离至 腹主动脉分 又处 离断， 取 主动脉弓和腹 主动脉 ， 用 P B S缓冲液冲洗后 ， 放人 4 甲醛溶液L f | 固定( 时间 2 4 h ) 。取 出标 本 ， 经 脱 水 、 透 明 、 浸 蜡 、 石 蜡 包 埋 。 包埋的石蜡块常规 4 1 T I 连续切片、 摊 片、 干燥 、 脱 蜡至水 、 水洗 、 苏木精浸染、 1 氨水返蓝、 1 伊红染 液染色浸染 、 上行梯度酒精脱水 、 二 甲笨透明后 ， 中 性树胶封固， 光学显微镜下观察。 1 7 统 计 学方法采用 S P S S 1 6 0统
12、 计软 件分析 ， 数据采用 x 表示 ， 单用方差齐性检验 ， 方差不齐 的采用 We l c h检验 ， 采用单 因素方差分析 ， 并 两两 比较 分 析 ， P 0 0 5 ) ， 实验第 4 、 8 、 l 2周末， 2 组体 重 无 明 显 差异 ( P 0 0 5 ) ， 随实 验 时 间 延 长， 2 组兔体重明显增加 ， 差异有统 汁学意义( P 0 0 5 ) 。与 实验前比较 ， 实验第 4 、 8 、 1 2用末， 正常对照组兔血 浆 中 p I A 、 1 p P I A 。和 I P A 水 平无 明 显 改 变 ， 差 异无统训 学意义( P0 0 5 ) ； 慢性
13、缺氧组 兔血浆 【 I 中华老年心脑m错瘸杂志 2 0l 4年 2月 第 1 6卷 第 2期C h i n J( ；e r ia t r He a r t13 r a in Ve s s e l 1 ) is ， F e b 2 0 1 4 Vo l 1 6 ， N 2 组兔主动脉弓和腹主动脉有不同程度动脉粥样硬化 病变 ， 内膜表面粗糙 ， 伴有不同程度增厚 ， 可见泡沫 细胞蓄积 ， 细胞核呈圆形或椭圆形 ， 内膜下可见弹力 纤 维 断裂 ， 中膜 平 滑肌细 胞排 列纹 理 。 3讨论 高原地区缺氧状态对人体的影响， 在脑血管病 方面存在独特改变 。缺氧对动脉粥样硬化的影H 向， 通过复
14、杂的机制进行调节 。其 中体内氧化系统和抗 氧 化系 统失 衡 ， 活 性 氧 产 生 增 多 ， 炎 性 介 质 大 燧 释 放 ， 促使脂质代谢障碍 ， 导致血管内膜结构和功能障 碍 ， 形 成 恶性循 环 。而早 期 血 管 内膜 受 损 和 脂 质沉 积在 内膜下 ， 是启动和促进动脉j 卡 j 样硬化形成 的前 提条件。本研究通过降低缺氧箱内氧浓度 的方式 ， 使新西兰 白兔动脉血氧分压降低， 成功建立 了慢性 缺氧动物模型。结果显示 ， 慢性缺氧组新两兰 白兔 于第 1 2周 末 ， 主动脉 弓和 腹 主动脉 局部 内膜 存 在不 同程度的增厚 ， 脂质蓄积在 内膜下 ， 叮见空泡
15、， 而正 常对照组未见到上述表现 。张司兰等 。 的研究也有 相似 的报道 。 目前， P I A 家族分为五大类 ： 分泌型 P I A 、 细 胞溶 质 型 P I A： 、 钙 离子 非 依 赖 型 P I A 、 溶 酶 体 型 P 【 A 和 L p P I A。 。在 正 常 生 理 条 件 下， 血 清 F f 】 I I A。 水平低且稳定 ， 在缺氧时 ， 不同的 P I A。活化 水平有不同的变化 ， 但总体表现为总 P I A。 水平增 高 ， 如人 脐静 脉 皮细 胞 在 缺 氧 2 h后 ， 分泌 删 P L A。 活 性增 加 ， 细 胞 溶 质 型 P I A。活性 不 增 加 。 研究发现 ， 星形胶质细胞置于缺氧缺糖环境 中， 细胞 溶质 型 P I 。和 分 泌 型 P I A。水 平 和 活 性 都 增 加【 。 。人冠状动脉 内皮细胞在缺氧条件刺激下， 使 钙离子非依赖型 I I A 活性较正 常组 明显增加 。 梁标等 研究显示 ， 慢性低氧性肺动脉高压大 鼠( 每 日低氧 8 h ， 持续低氧 2 1 d ) 血液中的 P I A。 活性明 显 高 于正 常对照 组 5 本 研 究结 果 掘 示 ， 慢
