使用说明书使用说明书

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1、UscnUscnUscnUscn LifeLifeLifeLife ScienceScienceScienceScience Inc.Inc.Inc.Inc. WuhanWuhanWuhanWuhan网址: 电话: +86 27 84259552 传真: +86 27 84259551 E-mail: 小鼠神经纤维网蛋白小鼠神经纤维网蛋白小鼠神经纤维网蛋白小鼠神经纤维网蛋白 1(NRP1)1(NRP1)1(NRP1)1(NRP1)酶联免疫吸附测定试剂盒酶联免疫吸附测定试剂盒酶联免疫吸附测定试剂盒酶联免疫吸附测定试剂盒使用使用使用使用说明书说明书说明书说明书产品编号：E90692Mu 规格：9

2、6T 本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断! ! ! !预期应用预期应用预期应用预期应用 本酶联免疫吸附测定试剂盒运用双抗体夹心 ELISA 法定量测定小鼠组织匀浆、细胞裂 解液或其它相关生物液体中 NRP1 含量。本本本本试剂盒试剂盒试剂盒试剂盒已提供的试剂已提供的试剂已提供的试剂已提供的试剂试剂名称试剂名称数量数量试剂名称试剂名称数量数量96孔板(预包被)196孔板覆膜4标准品 (冻干)2标准品稀释液1 20ml检测溶液A (绿色)1 120l检测稀释液A(2 x)1

3、 6ml检测溶液B (红色)1 120l检测稀释液B(2 x)1 6mlTMB底物1 9ml终止液1 6ml浓洗涤液(30 x)1 20ml使用说明书1本本本本试剂盒试剂盒试剂盒试剂盒未提供但需自备的设备及试剂未提供但需自备的设备及试剂未提供但需自备的设备及试剂未提供但需自备的设备及试剂 1、45010nm 滤光片的酶标仪（建议仪器使用前提前预热） 2、单道和多道微量加液器及吸头 3、稀释样品的 EP 管 4、蒸馏水或去离子水 5、吸水纸 6、盛放洗液的容器试剂盒的储存及有效期试剂盒的储存及有效期试剂盒的储存及有效期试剂盒的储存及有效期 所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存。请注意，收到试剂盒后请

4、尽快将标准品、检 测溶液 A、检测溶液 B 以及 96 孔板保存于-20。开封后的酶标板要密封加干燥剂后保存 于-20，避免潮湿。有效期为 6 个月。实验原理实验原理实验原理实验原理 将 NRP1 抗体包被于 96 孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中依次加入标准品和标本，其中的 NRP1 与连接于固相载体上的抗体结合，洗板之后加入生物素化的 NRP1 抗 体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入 HRP 标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入底 物(TMB)显色。 TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成最终的黄 色。颜色的深浅和样品中的 NRP1 呈正相关。用酶标仪在 450n

5、m 波长下测定吸光度（ 值） ，计算样品浓度。标本的采集标本的采集标本的采集标本的采集与与与与保存保存保存保存 1、组织匀浆： 1） 取适量组织块，于预冷 PBS(0.02mol/L, pH 7.0-7.2)中清洗去除血液，称重后备用 (组织块较大需先剪碎后再匀浆)。 2）可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃匀浆器，加 入 510mL 预冷 PBS 进行充分研磨， 该过程需在冰上进行(有条件实验室可选用机 器匀浆)；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理(超声破碎过程中 注意冰浴降温；反复冻融法可重复 2 次)。 3）将制备好的匀浆液于 5000 g 离心

6、5 分钟，留取上清即可检测。 2、细胞裂解液： 1）贴壁细胞需要先用胰酶消化，离心收集细胞（悬浮细胞可直接离心收集） ； 2）将收集到的细胞用冷 PBS 洗 3 次； 3）物理方法裂解细胞（可先超声破碎细胞，再反复冻融） ： i 超声破碎：取适量 PBS 重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急 剧震荡破裂。 ii 反复冻融：将待破碎的细胞在-20以下冰冻，室温融解，反复 3 次，使细胞溶胀 破碎。 4）将标本于 2-81500xg 离心 10 分钟，收集上清备用。 3、其它生物标本： 请 1000 g 离心 20 分钟， 取上清即可检测， 或将上清置于-20或-80 保存，但应避免

7、反复冻融。 注注注注意意意意： 1、 以上标本均需密封保存，4保存应小于 1 周，-20不应超过 1 个月，-80不应超 过 2 个月。 2、 标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。试剂试剂试剂试剂准备准备准备准备 1、 使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25)，试剂不能直接在 37溶解。 2、 标准品标准品（冻干品） ：每瓶 标准品用标准品稀释液标准品稀释液稀释至 1mL，盖好后室温静置大约 10 分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为 40 ng/mL(贮液)。先将其稀释为 10 ng/mL(标准曲线最高浓度)后，再准备 7 个稀释标准品的 EP 管，每个 EP 管

8、中加入 500的标准品稀释液标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成 10 ng/mL，5 ng/mL，2.5 ng/mL， 1.25 ng/mL，0.625 ng/mL，0.312 ng/mL，0.156 ng/mL，标准品稀释液（0 ng/mL) 直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。TubeTubeTubeTube1 1 1 12 2 2 23 3 3 34 4 4 45 5 5 56 6 6 67 7 7 78 8 8 89 9 9 9 ng/mLng/mLng/mLng/mL4040404010101010

9、5 5 5 52.52.52.52.51.251.251.251.250.6250.6250.6250.6250.3120.3120.3120.3120.1560.1560.1560.1560 0 0 03、 检测稀释液检测稀释液 A A A A 及及检测稀释液检测稀释液 B B B B：用 6mL 蒸馏水或去离子水将 6mL 浓检测液 A 及 B 稀释至 12mL，进行 2 倍稀释，稀释后的工作液不宜进行冷冻保存。 4、 检测溶液检测溶液 A A A A 及及检测溶液检测溶液 B B B B：DetectionA及 Detection B 在使用前请手甩几下或少时 离心处理， 以使管壁或瓶盖

10、的液体沉积到管底。 临用前分别以检测稀释检测稀释液液A A A A或或 B B B B1:100 稀释（如：10检测溶液A/ 990检测稀释液 A） ，充分混匀，稀释前根据预先计算 好的每次实验所需的总量配制（100 /孔） ，实际配制时应多配制 0.1-0.2mL。 5、 浓洗涤液浓洗涤液：用 580mL 蒸馏水或去离子水将 20mL 浓洗涤液稀释至 600mL，进行 30 倍稀释。 6、 底物溶液：底物溶液：请用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的 TMB 至另一干净容器中使用，容 器中剩余的底物应予丢弃，不要倒回 TMB 瓶中。 注注注注意意意意： 1、 标准品标准品请于临用前 15 分钟内配

11、制。该标准品只能使用一次。该标准品只能使用一次。 2、 标准品的稀释不能直接在板中进行。 3、 标准品标准品、检测溶液检测溶液 A A A A 工作液工作液、检测溶液检测溶液 B B B B 工作液工作液请使用相应的稀释液配制，不能混 淆。混匀时要轻轻充分混匀，避免起泡。为保证实验结果的准确请使用微量吸管， 并 校准微量加液器。请依据所需的量精确配制，尽量不要微量配制（如吸取检测溶液检测溶液 A A A A 时，一次不要小于 10 ） ，以避免造成浓度误差。 4、 请勿重复使用已经稀释过的标准品、标准品、检测溶液检测溶液 A A A A 工作液工作液和检测溶液检测溶液 B B B B 工作液工

12、作液。 5、 浓洗涤液浓洗涤液中如有结晶析出，请先温育至室温，轻轻混匀，至到结晶完全溶解再进行配 制。操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤 实验前应预测标本含量，如果标本浓度过高，应对标本进行稀释，使稀释后的标本符 合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。 1、 加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔 7 孔，依次加入 100不同 浓度的标准品（见试剂准备 2） 。空白孔加 100（见试剂准备第二步最后一管） ， 余孔加待测样品 100 ，酶标板加上覆膜，37温育 2 小时。 2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。 3、 每孔加检测溶液检测溶液 A A A A 工作液工作液 100 （

13、临用前配制） ，酶标板加上覆膜，37温育 1 小时。 4、 弃去孔内液体，每孔用 350的洗涤液洗涤，浸泡 1-2 分钟，甩干（也可轻拍将孔内 液体拍干） ，重复洗板 3 次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。 5、 每孔加检测溶液检测溶液 B B B B 工作液工作液（临用前配制）100，加上覆膜，37温育 30 分钟。 6、 弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，方法同步骤 4。 7、 每孔加底物溶液底物溶液 90，酶标板加上覆膜，37避光显色避光显色（反应时间控制在 15-25 分 钟，不要超过 30 分钟。当标准孔的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔梯度不明显时，即可终

14、止） 。 8、 每孔加终止溶液终止溶液 50，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与 底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动 酶标板以使溶液混合均 匀。 9、 在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光 密度（值） 。 注注注注意意意意： 1、 试剂准备试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说 明书要求保存，以备下次使用。 2、 加样：加样：实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡， 将 样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，第一个孔 与最后一

15、个孔加样之间的时间间隔如果太大， 将会导致不同的 “预温育”时间， 从而明 显地影响到测量值的准确性及重复性。 因此， 一次加样时间 （包括标准品及所有样品） 最好控制在 10 分钟内。推荐设置复孔进行实验。 3、 温育温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体 蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应 严格遵守给定的温育时间和温度。 4、 洗涤洗涤：充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液完全甩干。洗涤过程 中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要 消除板底残留的液体和手指印，避免影

16、响最后的酶标仪读数。 5、 反应时间的控制：反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔 10 分钟观 察一次） ，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪 光密度读数。 6、 底物：底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。洗板方法洗板方法洗板方法洗板方法 1、 手工洗板方法： 将推荐的洗涤缓冲液至少 0.35mL 注入孔内， 浸泡 1-2 分钟， 吸去 （不 可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力 拍几次；根据需要，重复此过程数次。 2、 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。计算计算计算计算 各标准品及样本值扣除空白孔值后作图（七点图） ，如设置复孔，则应取 其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标） ，值为横坐标（对数坐标） ，在 对数坐标纸上绘出标准曲线（最佳方程式应依回归方程计算的 R2值来定，以 R2值越趋近 于 1 为好） 。推荐使用专业制作