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1、第 1 页 共 16 页细胞工程项目申请书细胞工程项目申请书生物工程:也称生物工艺学(biotechnologyorbioprocess),一般称为生物技术。一般意义上讲,生物工程是以生命科学为基础,利用生物体系和工程学原理生产生物产品和创造新物种的一门综合技术。换言之,就是利用生物有机体(从微生物直至高等动物)或其组成部分(器官、组织、细胞等)发展新工艺或制造新产品的一种科学技术。细胞工程:应用细胞生物学和分子生物学的方法,通过类似于工程学的步骤,在细胞整体水平或细胞器水平上,按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获取新型生物或特种细胞产品的一门科学技术。第二章细胞工程基础1.细胞分化(ce
2、lldifferentiation)的概念同型的胚胎细胞,在细胞分裂、发育过程中,形态结构、生化组成、生理过程上产生专一性和特异性的现象,称细胞分化。是细胞功能和形态逐渐转化、产生稳定组织差异的过程。2.细胞分化的分子基础是细胞决定(determination)细胞的分化可被识别之前,细胞沿着特定方向变化的能力已经被提前赋予了,这种现象称细胞决定。是细胞分化潜能逐渐受限的过程。分化的本质:细胞按照一定的时空顺序差异基因表达(differentialgeneexpress)。如奢侈基因(luxurygene),持家基因(house-keepinggene)。3、影响细胞分化的因素(1)胞外信号分
3、子的诱导作用(一部分细胞对周围细胞的分化诱导):如成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)。(2)激素的诱导:第 2 页 共 16 页(3)细胞质的不均一性:如卵和受精卵。(4)“位置效应”:细胞在组织和机体内的位置影响其分化。(5)外部环境条件对分化的影响:如早期胚胎中,胚胎表面的细胞滋养外胚层,内部的细胞内细胞团(将形成胚胎)。如动物卵细胞未经排卵而被激活,将在卵巢中异位发育成畸胎瘤。细胞分化的时空性时间上的分化:指一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能,不同的发育时间细胞之间的区别。空间上的分化:指处于不同空间位置中的同一种细胞后代之间出现的差异。单细胞生物仅有时间
4、上的分化,如噬菌体的溶菌型和溶原型。多细胞生物的细胞不但有时间上的分化,而且由于在同一个体上的各个细胞所处的位置不同,因而发生机能上的分工,于是又有空间上的分化,如一个植物个体在其顶端、根、茎、叶等不同部位具有不同的细胞。4.细胞分化潜能:细胞分化能力的强弱称为发育潜能。5.植物细胞的分化潜能:植物细胞在发育潜能上,高度分化的植物营养组织仍保持着发育成完整植株的能力,即具有全能性。6.细胞分化潜能逐渐变窄7.全能细胞(totipotentcell):单个细胞在一定条件下分化发育成为完整个体的潜能称为细胞的全能性。8.多能细胞(pluripotentcell):虽然局限,但仍有发育成多种表型细胞
5、的能力,这种细胞称为多能细胞。第 3 页 共 16 页9.单能细胞(unipotentcell):形态上、功能上专一化的终末分化细胞,被称为单能细胞。10.生物的每一个细胞经过分裂和分化后,仍然保持发育成完整个体的潜在能力,这种特性称细胞的全能性。原因:细胞具有这种潜能是因为每个细胞都包含了这个物种的所特有的全套遗传物质,具有发育成为完整个体所必需的全部基因。细胞的全能性为开展细胞工程研究提供了广阔空间。11.细胞表现出全能性的条件:离体状态、具有一定营养物质、激素和其他外界条件12.细胞周期:细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分完成所经历的一个有序过程。其间细胞遗传物质和其他内含物分配给子细
6、胞。13.细胞周期时相组成:14.无丝分裂(amitosis):又称直接分裂,由Remark(1841)发现于鸡胚血细胞,不涉及纺锤体形成及染色体变化。胞核拉长,核中间断裂,胞质一分为二。低等动物、植物胚乳发育、动物上皮组织、疏松结缔组织、肌肉组织、肝细胞有无丝分裂。优势:分裂快、能耗少、分裂中细胞功能继续发挥利于细胞对外界环境变化作出迅速反应。缺陷:遗传物质不能有效均等分配。有丝分裂(mitosis):又称为间接分裂,由Fleming(1882)年首次发现于动物,Strasburger(1880)发现于植物。减数分裂(meiosis):染色体复制一次,细胞连续分裂两次。是发生于有性生殖个体生
7、殖细胞的一种特殊的有丝分裂方式。15.间期:完成组成染色体的DNA分子的复制和有关蛋白质的合成。第 4 页 共 16 页前期:出现染色体、核膜解体、核仁消失、形成纺垂体。中期:染色体排列到赤道面上。后期:姐妹染色体单体分开并移向两极的时期。期末:从子染色体到达两极,至形成两个新细胞为止。16.减数分裂染色体经过复制一次后,要经过两次分裂,形成四个细胞,结果子细胞的染色体数目比亲代细胞减少了一半。第三章植物组织与细胞培养1.胚胎培养(embryoculture):包括原胚和成熟胚培养、胚乳培养、胚珠和子房(未授粉或已授粉的)培养,可用于研究胚胎发生以及影响胚生长的因素;用试管受精或幼胚培养可获得
8、种间或属间远缘杂种,因此它也是研究生殖生理的有用方法;胚乳培养是研究胚乳的功能、乳与胚的关系,以及获得三倍体植株的一个手段。脱分化(dedifferentiation):已分化好的细胞在人工诱导条件下,恢复分生能力,回复到分化组织状态的过程。再分化(redifferentiation):脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程,重新形成各类组织和器官的过程。茎尖培养:较小的仅带几个叶原基或少量幼叶的茎端部分的培养。通常用110mm大小的外植体来加速植物的无性系繁殖。无性繁殖系(clone):由同一个外植体反复进行继代培养后所得一系列的无性繁殖后代。器官发生(organogenesi
9、s):在组织培养中或悬浮培养中,由培养物到显示有自然的器官形成,如形成芽或根的现象。胚状体(embryoid):在离体培养过程中产生一种形似胚(具有明显的根端和芽端),功能与胚相同的结构。2.一般植物通过细胞或组织培养达到再生目的要经过两个步骤:第 5 页 共 16 页(1)培养的植物细胞或组织的脱分化,形成愈伤组织;(2)有新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团,随后又由其分化成不同的器官原基(如根原基、叶原基等)。3.脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式:(1)器官发生方式:其中芽和根在愈伤组织的不同部位分别独立形成,具有单极性结构。(2)胚胎发生方式:在愈伤组织表面或内部形成很多胚
10、状体,它们类似于合子胚,具有双极性结构。4.通过胚状体途径产生再生植株有3个显著优点:(1)在一个培养物上所能产生的胚状体数目往往比不定芽数目多;(2)胚状体形成的速度快;(3)胚状体结构完整,一旦形成,一般都可以直接萌发形成小植株,因此成苗率高。5.6.启动期(或诱导期):是成熟组织在各种刺激因素的诱导作用下细胞内蛋白质及核酸的合成代谢迅速加强的过程。受激作用后分裂前细胞的主要变化有:一是呼吸作用加强,消耗氧量明显增加;二是多聚核糖体的不断增加,到有丝分裂前RNA的含量可增加300%;三是蛋白质合成加快,分裂前细胞内蛋白质的总量增加200%;四是各种与分裂有关的酶活性大大加强。分裂期:其主要
11、特征是:细胞数目增加很大,结构疏松,缺少有组织特征的结构,一般呈现透明状或浅颜色。分化期:停止分裂的细胞发生生理代谢方面的变化,出现了形态和生理功能上的分化,直至出现了分生组织的瘤状结构及维管组织。此时,细胞体积不再减小,呈现的颜色多种多样。第 6 页 共 16 页7.影响愈伤组织培养的主要因素外植体:虽然所有植物都有被诱导产生愈伤组织的潜在能力,但是不同的植物种类诱导形成愈伤组织的难易程度差别很大。基本培养基:众多的培养基基本上都可以诱导出愈伤组织,但不同的植物种类、基因型和外植体诱导形成愈伤组织的难易程度不同,对培养基的反应也有差别。激素组合:通常高浓度的生长素和低浓度的激动素有利于愈伤组
12、织的诱导和增殖。其中,2,4-D是诱导愈伤组织最有效的物质。8.举例:以番杏的组织培养为例介绍组织器官培养技术:番杏别名洋菠菜,属番杏科番杏属的多年生草本植物。主要以肥厚多汁的嫩茎叶作蔬菜食用,并可全株入药,有凉血、解毒、利尿、消疮疥等的功效。具体方法如下:(1)材料和培养基:番杏果实和幼苗;(1)芽分化培养基:MS+6-BA1.0mg/L(单位下同)+NAA0.1+3.0%蔗糖;(2)诱导愈伤组织与分化培养基:MS+6-BA1.0+2,4-D0.5+3.0%蔗糖;(3)生根培养基:3/4MS+NAA0.1+1.5%蔗糖;(4)继代培养基:MS培养基。以上各培养基加0.7%琼脂,PH5.8。(
13、2)培养条件:培养温度25左右,日光灯照明,每天光照10h,光照强度10001500lx。(3)无菌苗的获取:将番杏果实在浓硫酸中浸泡约1h,流水冲洗30min。再在超净工作台(图示)内用70%乙醇浸泡2-3min,在无菌滤纸上吸干或酒精灯焰烧干,再用0.1%升汞浸泡10min,无第 7 页 共 16 页菌水冲洗3-4次,用无菌手术刀轻轻刮去果实被腐蚀的部分,然后将其接种于培养基(3)中,培养1周后种子长出无菌苗(图示)。(4)愈伤组织培养:切取0.5cm长的不带腋芽的茎段,置于(2)号培养基上。3周后,茎段周围出现白色松脆的愈伤组织(图示)。愈伤组织的形成标志着接种外植体的生长状态已脱离分化
14、状态,开始重新恢复分生能力。(5)继代培养:将愈伤组织在无菌条件下从试管中取出,用无菌水洗净,以镊子和解剖刀剔除附着在愈伤块上的培养基,并用无菌水反复冲洗数次,直至愈伤块上无残留培养基为止。用解剖刀将愈伤块切成数小块,在接种到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中,再与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。几天后,三角瓶中的小愈伤块即可逐渐长大,这一过程称作继代培养。通过愈伤组织的继代培养,原来接种的1个番杏茎段组织可繁殖出大量的新接种材料用于分化培养。(6)分化培养:剥离白色松脆的愈伤组织继续置于(2)号培养基上,2月后,部分白色愈伤组织上出现绿色芽点(图示)。随着时间推移,绿色芽点不断膨大,其中
15、部分形成正常绿苗(图示)。(7)生根培养:剥离绿苗接种到(3)号培养基上诱导生根(图示)。d后开始陆续出根,3周后可有多条须根形成,生根率达95.7%。(8)炼苗与移栽:移栽前,敞瓶炼苗3-4d,取出洗净后,栽至装有蛭石的塑料杯中,加自来水,杯上罩上玻璃烧杯保湿,4d后昼覆夜敞,2周后可除掉玻璃杯。3周后,试管苗张出新根,再将其移入蛭石与土(2:1)的盆(图示)中。成活率为83.3%。9.思考题第 8 页 共 16 页1.愈伤组织的形态发生有哪两种情况并比较各自由此形成完整植株的不同。2.请以某种植物为例来论述其无菌苗的诱导、继代快繁、生根培养及其驯化移栽过程。3.植物组织培养的主要意义有哪些
16、最新进展如何10.所谓高质量的体细胞胚,指的是体细胞胚具有发育成完整小植株的能力,这就要求体细胞胚在解剖构造上具有明显的胚根、胚芽的双极性结构,这是人工种子制作能否成功的关键所在。11.人工种子的制作要求胚状体的形态上大小一致,发育进程上相似,这样制成的人工种子其活力强,萌发率高。如何对体细胞胚胎发生进行同步化控制和纯化筛选呢(1)化学抑制法(2)低温抑制法(3)渗透压选择法(4)机械过筛选择法(5)应用植物胚性细胞分级仪化学抑制法:在细胞培养初期加入抑制DNA合成的药物,使细胞DNA合成暂时停止,当除去DNA抑制剂时,细胞开始进入同步分裂。低温抑制法:采用低温处理导致发育停滞,形成所谓的温度冲击,处理时间过后,恢复正常温度,可以使胚性细胞达到同步分裂的目的。低温抑制法:采用低温处理导致发育停滞,形成所谓的温度冲击,处理时间过后,恢复正常温度,可以使胚性细胞达到同步分裂的目的人造种皮要求:能保持胚状体的活力,利于萌发或贮藏。如海藻酸钠、明胶、树胶、琼脂糖、淀粉及动物胶等。人造胚乳人工胚乳的主要成分为无机盐、碳水化合物及蛋白质等营养物质。包埋技术:滴注法;装模法.第 9 页
