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1、第 5 卷 第 7 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 5 No. 7 2014 年 7 月 Journal of Food Safety and Quality Jul. , 2014 *通讯作者: 任一平, 教授级高级工程师, 主要研究方向为卫生理化检验技术及食品安全检验技术。E-mail: *Corresponding author: REN Yi-Ping, Senior Engineer, Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, NO.3399, Binsheng Road, B
2、injiang District, Hangzhou 310051, China. E-mail: 利用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱定量 检测人乳中的 -乳白蛋白 陈 启1, 赖世云1, 张京顺2, 任一平2* (1. 贝因美婴童食品股份有限公司, 杭州 310057; 2. 浙江省疾病预防控制中心, 杭州 310051) 摘摘 要要: 目的目的 建立一种新型基于多肽标准品体系的人乳 -乳白蛋白的定量检测方法。方法方法 从人乳 -乳白蛋白筛选出特异性多肽, 并建立对应的检测方法; 利用化学方法人工合成特异性多肽、同位素标记特异性多肽和内标。 结果结果 本方法所选择的多肽具有高度特异性,
3、-乳白蛋白的检测灵敏度为 8.0 mg/100 g, 精密度均小于5.22%, 回收率均在 97.21%102.45%之间。 结论结论 本方法建立了利用特异性多肽检测人 -乳白蛋白的方法, 具有较高的准确度、 灵敏度和稳定性。 通过对 447 份人乳样品进行检测, 初步探索了人乳中 -乳白蛋白的含量范围, 为人乳化配方奶粉的华人配方奠定理论基础。 关键词关键词: 人乳; 液相色谱串联三重四级杆质谱; -乳白蛋白; 多肽标准品体系 Quantification of -lactalbumin in human milk based on ultra-performance liquid chro
4、matography coupled with tandem mass spectrometry CHEN Qi1, LAI Shi-Yun1, ZHANG Jing-Shun2, REN Yi-Ping2* (1. Beingmate Baby 2. Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310051, China) ABSTRACT: Objective To establish a quantitative detection of -lactalbumin in human mil
5、k with peptide standard system. Methods The signature peptide for -lactalbumin was searched and selected from the pro-tein digestion products. The signature peptide, isotope-labelled signature peptide and internal standard peptide were also synthesized and used for establishing the quantification me
6、thod. Results The limit of quantification for -lactalbumin was 8.0 mg/100 g. Reproducibility were below 5.22% and spiked recoveries were between 97.21%102.45%. Conclusion The validation showed that the method was with high selectivity, accuracy, reproducibility and sensitivity. The analysis results
7、of 447 human milk samples provided the theoretical basis for infant formula suitable for Chinese babies. KEY WORDS: human milk; UPLC-MS/MS; -lactalbumin; peptides standard system 1 引 言 人乳中的蛋白质含量约为 1%2%1-4。 它可以分为酪蛋白以及乳清蛋白, 其比例约为 4:65。 -乳白蛋白为主要的乳清蛋白, 占人乳含量的 0.25%左右。它能作为载物与钙、镁、锰、钠、钾以及锌6-8结合。Pellegrini等
8、9对牛-乳白蛋白的研究发现, 其水解产物还具有抗菌作用。 2096 食品安全质量检测学报 第 5 卷 在牛乳中的酪蛋白以及乳清蛋白比例约为8:210, 同时乳清蛋白主要是由 -乳白蛋白与 -酪蛋白构成。 所以在调制以牛奶为基质的人乳化配方乳粉时, 需要将其蛋白质比例, 尤其是 -乳白蛋白含量, 调节至类似人乳的比例, 以利于婴幼儿营养吸收。 现阶段国内外对人乳中的蛋白质的定量分析研究主要停留在总蛋白含量测定水平上: 利用凯氏定氮法检测蛋白氮与非蛋白氮11,12, 以及酪蛋白和乳清蛋白13。 而对单一蛋白质的定量研究并不多, 主要采取的检测方法为反相色谱法14、离子交换色谱15、电泳法15,16
9、以及免疫学方法17。 单一蛋白质检测方法匮乏原因是多方面的。 首先上述电泳以及色谱等方法均需要提供高纯度的标准品进行定性以及定量分析, 免疫学方法需要纯净的人乳单一蛋白质用于制备抗体。 鉴于商品化的、 单一人乳蛋白质标准品非常难以得到, 也就难以建立上述检测方法。人乳中营养物质组成复杂, 利用色谱以及电泳法也难以将被测化合物与基质达到基线分离; 同时由于各种人乳蛋白质的理化性质十分接近, 无法有效区分相似蛋白质5; 利用免疫学方法不可避免地会产生交叉反应, 对检测结果会造成影响。上述仪器法的检测均采用紫外280 nm 检测, 该波长对所有的蛋白质均有吸收, 无法通过检测器对不同种类的蛋白质进行
10、区分; 同 时紫 外检测 器的 灵敏度 低, 检出限 约为 10 g/mL15。 Zhang 等18、Lutter 等19和 Heick 等20尝试利用蛋白质组学与液质联用技术分别对牛奶、 花生等蛋白质进行分析。 他们将蛋白质酶切成多肽根据现有的数据库从中筛选出特异性多肽以用于测定。 但是这些方法依然在定量准确度、 标准品和内标设计等方面存在不同的问题。 现阶段没有任何利用该方法检测人乳蛋白的文章发表。 本文利用同样的检测原理, 筛选出合适的人 -乳白蛋白特异肽用于定性与定量检测。 同时人工合成高纯度的该特异多肽作为标准品, 使用同位素标记的氨基酸合成内标, 排除了酶解、分离和质谱离子化、样品
11、基质等干扰问题。从而建立一套新型的基于多肽的标准品体系, 满足无蛋白质标准品情况下准确定量检测的需要。 2 材料与方法 2.1 试 剂 碳酸氢铵, 二硫苏糖醇(DTT), 碘代乙酰胺(IAA), 乙酸, 甲酸, 乙腈, 碳、氮全同位素标记的亮氨酸(L*)购自美国Sigma-Aldrich公司, 重组猪胰蛋白酶购自上海雅心生物技术有限公司。 标准物与内标: 特异肽: CELSQLLK(纯度98%, 水 分 1%), 同 位 素 特 异 肽 CELSQL*L*K, 内 标AKQFTKCELSQL*L*KDIDGYGGIA, 由上海强耀公司合成。其中带*的氨基酸为碳、氮全同位素标记的氨基酸。 2.2
12、 仪器工作条件 2.2.1 超高压液相色谱(UPLC)参数 液相色谱仪: Acquity Ultra Performance LC(美国Waters 公司); 色谱柱: BEH 300 C18 (100 mm2.1 mmi.d., 1.7 m, 美国 Waters 公司); 柱温: 40 C, 样品室温度: 4 C, 进样体积: 5 L; 流动相 A: 含 0.1%甲酸的水溶液, 流动相 B: 含 0.1%甲酸的乙腈溶液, 流速 0.3 mL/min, 梯度洗脱条件: 在 5 min 内将流动相 B 含量从 3%提升至 32%。 2.2.2 三重四级杆质谱(MS)参数 质谱仪: TQ-S MS
13、 Xevo(美国 Waters 公司), 带ESI 源。毛细管电压: 3.0 kV, 脱溶剂温度: 500 , 脱溶剂气流量: 900 L/min, 锥孔反吹气流量: 150 L/h, 碰撞室压力: 3.0103 mbar; 低端分辨率 1:2.5 V, 高端分辨率 1:15.0 V, 离子能量 1:0.5; 低端分辨率 2:2.8 V, 高端分辨率 2:15.0 V, 离子能量 2:1.0; 离子源温 度: 150 C, 提取器电压: 3.0 V, 入口透镜电压: 0.5 V, 出口电压: 0.5 V, 碰撞梯度: 1.0, 多离子反应监测(MRM)参数见表 1。 2.3 标准曲线的配制 分
14、别将特异肽 CELSQLLK 和同位素特异肽CELSQL*L*K 用水溶解, 再配制成浓度为 0.1、0.6、1.2、 1.8、 2.4、 3.0 mol/L 的特异肽标准曲线溶液, 与1.5 mol/L 的同位素特异肽溶液。 由于本实验所合成的特异肽和同位素特异肽含有半胱氨酸C, 需在进样前破坏分子间的潜在的二硫键, 并使其烷基化, 故取 20 L 的标准曲线溶液, 加入10 L同位素特异肽溶液, 10 L的50 mmol/L DTT溶液与 945 L 水, 在 55 水浴锅中反应 30 min。待 第 7 期 陈 启, 等: 利用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱定量检测人乳中的 -乳白蛋白
15、 2097 表 1 MRM 参数 Table 1 Conditions of multiple reactions monitoring 多肽序列 母离子 m/z 锥孔 电压 V 子离子 m/z 碰撞 能量 eV 裂解 方式CELSQLLK 495.8 15 290.1* 18 b2 588.5 18 y5 701.8 18 y6 CELSQL*L*K 502.8 15 290.1* 18 b2 602.5 18 y5 715.8 18 y6 *标记的子离子为定量子离子 冷却后加入 10 L 的 150 mmol/L IAA 溶液, 在暗处室温静置 30 min。最后加入 5 L 甲酸溶液,
16、待测。 2.4 人乳酶解 将人乳 1:100 用水稀释, 经充分混匀后, 取 20 L 人乳稀释液, 加入 10 L 内标溶液(1.5 mol/L), 10 L 的 50 mmol/L DTT 溶液与 835 L 水, 在 55 水浴锅中反应 30 min。待冷却后加入 10 L 的 150 mmol/L IAA 溶液, 在暗处室温静置 30 min。 加入 100 L 500 mmol/L 的碳酸氢铵缓冲液与 10 L 200 g/mL 的碱性胰蛋白酶, 在 37 C 水浴锅中反应 2 h。最后加入5 L甲酸溶液终止反应, 用0.22 m微孔滤膜过滤, 待测。 3 结果与讨论 3.1 特异多肽的选择 本文选择碱性胰蛋白酶作为酶切工具, 利用其高度专一性, 水解精氨酸
