现代生化药学复习提要

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1、第一章 英文全称：合酶链式反应 发明者：）基本原理：以拟扩增的 子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在 合酶的作用下，按照半保留复制机制沿着模板链延伸直至完成新的 成，并不断重复这一过程。A混合模板 种核糖的三磷酸盐和 合酶，加入过量的 2 种 物，与模板中需要的序列的起始和结束区域结合。B加热反应液至 94以使模板 双链变成单链（变性）C冷却至 50，引物与模板 单链结合（退火）D升温至 72，合酶催化 制以产生双螺旋 伸）E重复步骤2满意为止。应的产物中一般会生成的不同长度的产物以及反应结束时的含量：一种是预期长度的片度，即目的产物，以指数级数 2种是比预期长度长的多的产物

2、，以几何级数 2n 增加，在总产物中所占的比重很小，可以忽略。一般 应中包括的基本成份及其功能：模板 扩增序列的核酸） 、特异性引物（靶 3端和 5端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定 异性的关键） 、热稳定 合酶（53聚合作用、35的外切酶活力、53的外切酶活力） 、脱氧核苷三磷酸（料，四种 浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入降低合成速度，过早终止反应） 、二价阳离子（影响 特异性和产量，所有热稳定的 合酶都要求有游离的二价阳离子作为辅助离子，浓度必须超过 引物来源的磷酸盐基团浓度，常用的是 +优于 而 任何作用 足产量低，过高非特异产物。 ） 、缓冲液（维持 应

3、体系的 一价阳离子（标准的 冲液中包含 50 的 对于扩增大于 500度 段是有益的；提高 度到 70100 对扩增较短的 段产物是有益的） 、石蜡油（减少 程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失，可省）应模板种类及质量要求：种类：基因组 粒 菌体 先扩增 几乎所有形式的 可作为 应的模板。质量要求：对模板的纯度要求不是很高，经过标准分子生物学方法制备的样品并不需要另外的纯化步骤，但样品中的有些成分（如菌种保护剂等）会影响 应。要求：模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、合酶抑制剂以及能结合 蛋白。尽管模板的长度不是 增的关键因素，但小片段模板的 率要高于大片段分子。除了纯化的 ，

4、应还可以直接以细胞为模板。为了保证反应的特异性，还应用 的克隆 g 水平的单拷贝染色体 104 拷贝的待扩增片段作为起始材料。物：所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶 引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的 5端决定扩增产物的 5末端位置。特异性引物：引物是与靶 3端和 5端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定 异性的关键。只有当每条引物都能特异性地与模板 的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。一般越长特异性越高。简并性引物：简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。引物设计的基本原则：物

5、长度一般最低不少于 16 个核苷酸，而最高不超过 30 个核苷酸，最佳长度为 2024 个核苷酸。B.（G+C）%含量：在已知扩增片段（G+C）%含量适宜接近待扩增片段，一般以 40%60%为佳。其是发卡结构。别是在引物 3端，否则易形成“引物二聚体” 。端配对：其 3端 56 个碱基与靶 配对要求必须精确与严格。使用的 合酶及其各自特点：（1）段 35外切酶活性，最适 37，不可耐受 95的双链 变性温度。 （2） 可耐受 9395的高温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物和 级结构对 干扰，增进了 异性、产量和敏感度。 二者的主要区别：1的最适

6、温度为 37，扩增的产物并非全是目的序列，需要探针检测。不仅产率高而且特异性也高。它的最适温度为 7475。因而使退火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。2 循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平坡的循环次数 为 20 个，为 30 个。3 延伸片段长度 为 10内；而 为 400内。 第二代耐热 合酶 段：去除 53外切酶片段，衰期 20（4）合酶：更加耐热，且具有 35外切酶活性的校正能力。错配率低。 （5）转录酶：有很好的依赖于 耐热 合酶活性和依赖于 耐热 合酶活性，二种活性分别依赖于 +，应中对于加入的 要求：4 种等浓度的脱氧核苷三磷酸，即 种 浓度一般在50200

7、，不能低于 1015。过高：抑制酶活性，错误掺入。过低：降低反应物产量。四种 浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入降低合成速度。过早终止反应。常容易降解，不要反复冻融。应一般步骤及其特点：过加热使模板 时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除；双链 板的变性温度有 G+C 含量来决定，模板 G+C 含量较高，溶解温度也较高。变性的时间由模板 子的长度来决定，子较长，两条链完全分开所需的时间也较长。温度下降至适宜温度，使引物与模板 火结合；退火是使引物和模板 性。复性过程采取的温度（关重要。复性温度过高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率很低。复性温度太低，引物将产

8、生非特异性复性，导致非特异性的 段的扩增。退火温度通常在比理论计算的引物和模板的熔解温度低 35的条件下进行。温度升高，热稳定 合酶以 底物催化合成新生 延伸。在热稳定合酶催化 成的最适温度下进行。循环数：增所需是循环数取决于反应体系中起始点模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。反应平台的概念：反应平台即扩增平台，所谓平台就是 环的后期，合成产物达 ，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦的曲线。反应平台形成的可能原因：1 引物和 消耗完毕 2失活 3 与底物过剩，非特异性扩增产物的竞争 4 退火时产物的单链自己缔合、变性 6 在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用等

9、。提高 应的特异的性一般方法：（1）引物设计（2）使用热启动：模板变性之后再加入 合酶（或 合酶才具有活性）的方法，可以提高反应的特异性，防止低温非特异性扩增（3）镁离子浓度：较高的 度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。 （4）促进 添加剂（5）使用巢式 用的促进 异性的试剂有哪些：单酰胺、油、甜菜碱以及 们可能的机理是降低溶解温度，从而有助于引物退火并辅助 合酶延伸通过二级结构区。热启动：在 应后，模板变性之后再加入 合酶（或 合酶才具有活性）的方法。全称：of 端快速扩增。定量 用 应来测量样品中的 原始模板拷贝数量。对产物进行终点检定量不准确的原因：理论上 一个指数增加的

10、过程，但是实际的 增曲线并不是标准的指数曲线，而是 S 形曲线。这是因为随着 环的增多，扩增规模迅速增大，物，甚至 板等各种 素逐渐不敷需求，率越来越低，产物扩增的速度就逐渐缓慢。当所有的 饱和以后，进入了平台期。即使是重复试验，各种条件基本一致，最后得到的 贝数也是完全不一样的，波动很大。传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是 终产物，而不是起始 贝数。由 贝数。定量 的定义以及 的确定：的含义是：增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省没置是 315 个循环的荧光

11、信号的标准偏差的 10 倍。试验操作中，定义为极限上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射所对应的 环次数。 “基线上方”也就是阈值高度的量化，定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的 10 倍。阈值所在的横线与 增曲线的交点所指的 环次数就是 。越小，模板 起始拷贝数越多；越大，反之。正常范围在 1830。简述 针技术的原理：针法是高度特异性的定量 术，其核心是利用 的 53外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在 针法的定量 应体系中，包括一对 物和一条探针。探针只与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间。探针的 5端标记有报告基团，3端标记有荧光淬灭基团，当探针完整的时候，报告基因所发出的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着 进行，在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其53外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个 环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号强度就代表了模板 拷贝数。解释下列各种 基本原理： (1) 先浆细胞裂解，除去细胞裂解物中的 蛋白质，得到细胞总的 总 获得 用亲和层析法，将 物连接与固相介质，将样品中的 成稳定的 合链，媳妇与固相介质上，最后用使杂合双链不稳定的缓冲液洗脱获得 ol