细胞生物学研究方法－王金发细胞生物学讲义

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1、2. 细 胞 生 物 学 研 究 方 法生 命 科 学 是 实 验 科 学 ， 它 的 很 多 成 果 都 是 通 过 实 验 得 以 发 现 和 发 展 的 。 方 法 上 的 突 破 ，对 于 理 论 和 应 用 上 的 发 展 具 有 巨 大 的 推 动 作 用 。 微 成 像 技 术最 早 的 光 学 显 微 镜 是 1590 年 他 的 侄 子 同 研 制 的 。 其后 ， 光 学 显 微 镜 的 分 辨 本 领 进 行 了 极 大的 改 进 ， 由 此 发 现 了 细 胞 。20 世 纪 30 年 代 发 展 起 来 的 电 子 显 微 镜 导 致 细 胞 结 构 和 功 能 研

2、究 发 生 了 一 次 革 命 ， 使生 物 学 家 得 以 从 亚 显 微 水 平 上 重 新 认 识 细 胞 (图 2图 2 学 显 微 镜 和 电 子 显 微 镜 下 的 细 胞 结 构 学 和 电 子 显 微 镜 成 像 原 理不 管 是 何 种 显 微 镜 ， 镜 像 的 形 成 都 需 要 三 个 基 本 要 素 : 照 明 系 统 ， 被 观 察的 样 品 ， 聚 焦 和 成 像 的 透 镜 系 统 (图 2图 2 学 和 电 子 显 微 镜 的 基 本 结 构在 光 学 显 微 镜 中 ， 照 明 系 统 是 可 见 光 ， 使 用 的 是 玻 璃 透 镜 系 统 ， 可 直

3、接 通 过 目 镜 观 察镜 像 。 在 电 子 显 微 镜 中 ， 照 明 系 统 为 电 子 束 ， 使 用 电 磁 透 镜 ， 通 过 荧 光 屏 观 察 样 品 的 镜 像 。照 明 系 统 的 波 长 是 显 微 镜 成 像 的 一 个 重 要 因 素 ， 因 为 波 长 决 定 能 被 检 测 样 品 的 最 小 极限 。 波 长 越 长 ， 波 幅 的 跨 度 就 越 大 ， 所 能 观 察 到 的 物 体 极 限 就 越 大 (图 2图 2 的 移 动 、 波 长 和 干 扰请 对 图 2 出 说 明 光 学 和 电 子 显 微 镜 成 像 的 光 学 原 理 是 相 同 的

4、， 其 中 最 重 要 的 是 光 子 和 电 子 都 具 有 波的 行 为 。 当 光 子 和 电 子 穿 过 透 镜 到 达 聚 焦 点 时 ， 由 于 波 的 干 涉 ( 质而 成 像 。 实 际 上 通 过 透 镜 观 察 到 的 样 品 的 镜 像 是 通 过 透 镜 波 的 干 涉 累 加 或 消 除 ， 即 衍 射( 结 果 。 焦 距 与 角 孔 径焦 距 ( 透 镜 的 中 心 平 面 到 焦 点 的 距 离 (图 2 而 角 孔 径 ( 光 从 样 品 进 入 显 微 镜 的 物 镜 半 角 (图 2 因 此 角 孔 径 实 际 表 示 有 多 少光 离 开 样 品 通 过

5、 透 镜 ， 最 好 的 光 学 显 微 镜 的 角 孔 径 大 约 是 700。图 2 镜 的 焦 距图 2 镜 的 角 孔 径角 孔 径 是 光 从 样 品 进 入 透 镜 的 半 角 。 (a)小 孔 径 透 镜 ;(b)大 角 孔 径 透 镜 。 角 孔径 越 大 ， 透 过 透 镜 的 信 息 越 多 ， 最 好 的 玻 璃 透 镜 的 角 孔 径 大 约 是 700 分 辨 率 ( 镜 最 重 要 的 性 质 就 是 它 的 分 辨 率 ， 分 辨 率 (R)可 用 以 下 公 式 计 算 : R = /n :n=聚 光 镜 和 物 镜 之 间 介 质 的 折 射 率 . 空 气

6、为 1. 油 为 =样 品 对 物 镜 角 孔 径 的 半 角 ， 最 大 值 为 1; =照 明 光 源 的 波 长 。 一 个 恒 定 的 参 数 ， 表 示 成 像 的 点 虽 被 重 叠 但 仍 能 被 区 别 的 程 度 。上 式 中 n 量 称 为 物 镜 的 数 值 孔 径 ( 缩 写 为 因此 显 微 镜 的 分 辨 率 的 表 示 公 式 可 改 为 :R= / 式 可 知 ， 角 孔 径 越 大 ， 进 入 物 镜 的 光 越 多 ； 介 质 的 折 射 率 越 大 ， 则 数 值 孔 径 越大 ， 这 些 都 可 以 使 分 辨 率 提 高 。由 于 分 辨 率 表 示

7、的 是 能 够 区 别 两 个 点 间 最 近 距 离 的 能 力 ， 所 以 R 值 越 小 ， 分 辨率 越 高 。 从 分 辨 率 的 表 达 式 来 看 ， 大 ， 分 辨 率 越 高 ， 或 者 波 长 越 短 ， 分 辨 率 越高 。 分 辨 极 限 ( 放 大 率 ( 一 般 地 说 ， 一 定 波 长 的 射 线 不 能 用 以 探 查 比 它 本 身 波 长 短 得 多 的 结 构 细 节 ， 这 是 一切 显 微 镜 的 一 个 基 本 限 度 。 对 可 见 光 来 说 ， 能 清 楚 地 分 辨 出 相 邻 两 点 之 间 的 最 小 间 隔 m， 称 之 为 分 辨

8、极 限 ( 最 终 成 像 的 大 小 与 原 物 体 大 小 的 比 值 称 为 放 大 率 。 总 放 大 率 = 物 镜 放 大 率目 镜 放 大 率 ， 放 大 率 同 样 受 分 辨 极 限 的 限 制 。 一 般 来 说 ， 光 学 显 微 镜 的 最 大 放大 率 只 能 是 透 镜 的 数 值 孔 径 的 1000 倍 。 由 于 透 镜 的 数 值 孔 径 的 范 围 所 以 光 学 显 微 镜 在 用 空 气 作 介 质 时 最 大 放 大 倍 数 为 1000 倍 ， 用 油 镜 则为 1400 倍 。 增 大 角 孔 径 或 缩 短 波 长 可 提 高 光 学 显 微

9、镜 的 分 辨 率 。 如 果 用 波 长 比 普 通 波 长 短 得 多的 电 子 波 代 替 光 波 ， 分 辨 率 可 大 大 提 高 ， 电 子 显 微 镜 就 是 在 这 种 需 求 下 被 发 明 的 。 表 2 学 显 微 镜 与 电 子 显 微 镜 某 些 特 性 的 比 较 。表 2 子 显 微 镜 与 光 学 显 微 镜 的 基 本 区 别分辨本领 光源 透镜 真空300 见光 玻璃透镜 不需真空200 镜) 可见光 玻璃透镜 不需真空光学显微镜100 外光 玻璃透镜 不需真空电子显微镜 0.1 子束 电磁透镜 用 的 光 学 显 微 镜光 学 显 微 镜 ( 光 学 显

10、微 技 术 的 主 要 工 具 ， 自 问 世 以 来 已 有400 多 年 历 史 。 光 学 显 微 镜 是 利 用 光 线 照 明 ， 使 微 小 物 体 形 成 放 大 影 像 的 仪 器 。 现 今 使 用的 光 学 显 微 镜 都 是 由 几 个 透 镜 组 合 而 成 ， 所 以 又 称 为 复 合 显 微 镜 (图 2 图 2 通 光 学 显 微 镜 的 基 本 结 构 普 通 双 筒 显 微 镜 ( 较 高 级 的 显 微 镜 上 都 设 有 倾 斜 式 的 双 目 镜 筒 (图 2 在 物 镜 转 换 器 上 方 装 有四 个 棱 镜 ， 使 经 过 物 镜 的 光 线 平

11、 分 为 两 路 到 达 目 镜 ， 故 双 筒 显 微 镜 的 亮 度 要 比 单 筒 者 为 暗 。双 筒 显 微 镜 的 优 点 为 同 时 用 两 眼 观 察 ， 有 较 强 的 立 体 感 。图 2 筒 显 微 镜 荧 光 显 微 镜 ( 光 显 微 镜 的 工 作 原 理 是 利 用 紫 外 线 发 生 装 置 (如 弧 光 灯 、 水 银 灯 等 )发 出 强 烈的 紫 外 线 光 源 ， 通 过 照 明 设 备 把 显 微 固 定 的 切 片 或 活 染 的 细 胞 透 视 出 来 ， 基 本 成 像 原理 示 于 图 2 2 光 显 微 镜 的 光 通 路 相 差 显 微 镜

12、 ( 差 显 微 镜 在 结 构 上 进 行 了 特 别 设 计 ， 尤 其 是 光 学 系 统 有 很 大 的 不 同 (图 2可 用 于 观 察 未 染 色 的 活 细 胞 (图 2图 2 差 显 微 镜 的 光 学 部 件 及 光 线 通 路图 2 差 显 微 镜 观 察 的 活 细 胞 暗 视 野 显 微 镜 ( 视 野 显 微 镜 是 利 用 特 殊 的 聚 光 器 使 照 明 光 线 不 能 进 入 物 镜 被 放 大 ， 在 黑 暗 的 背 景 下呈 现 明 亮 的 像 。 这 种 特 殊 的 照 明 方 式 ， 使 反 差 增 大 ， 分 辨 率 提 高 ， 用 以 观 察 未

13、 经 染 色 的 活体 或 胶 体 粒 子 (图 2图 2 视 野 显 微 镜 的 光 学暗 视 野 显 微 镜 主 要 观 察 的 是 物 体 的 轮 廓 ， 分 辨 不 清 内 部 的 微 细 构 造 ， 适 合 于观 察 活 细 胞 内 的 细 胞 核 、 线 粒 体 、 液 体 介 质 中 的 细 菌 和 霉 菌 等 。 倒 置 显 微 镜倒 置 显 微 镜 的 结 构 组 成 与 普 通 显 微 镜 一 样 ， 所 不 同 的 只 是 它 的 物 镜 与 照 明 系 统的 位 置 颠 倒 过 来 。 前 者 置 于 载 物 台 之 下 ， 而 后 者 在 载 物 台 的 上 方 。

14、集 光 器 与 载 物 台之 间 的 工 作 距 离 提 高 ， 可 以 放 置 培 养 皿 、 培 养 瓶 等 容 器 ， 直 接 对 培 养 的 细 胞 进 行照 明 和 观 察 (图 2 2 置 显 微 学 显 微 镜 的 样 品 制 备 与 观 察由 于 大 多 数 细 胞 的 成 分 不 影 响 光 线 的 穿 透 ， 无 法 形 成 反 差 ， 所 以 在 一 般 光 学 显 微 镜 下 ，几 乎 看 不 清 未 经 处 理 的 细 胞 。 为 了 看 清 细 胞 内 含 物 ， 就 必 须 对 细 胞 样 品 进 行 一 些 特 殊 的 处理 ， 为 此 建 立 和 发 展 了 样 品 的 各 种 制 备 技 术 。 样 品 的 固 定 ( 目 的 : 生 物 组 织 在 染 色 前 先 进 行 固 定 的 目 的 是 杀 死 细 胞 ， 稳 定 细 胞 的 化