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1、疾病基因克隆的策略及主要方法申海鹰 周元国（第三军医大学野战外科研究所分子生物学中心，重庆 400042） 摘要 疾病基因的分离和克隆是功能基因组学的研究热点，具体策略的选择取决于疾病背景资料的掌握程度，为能快速、准确地克隆出目的基因，本文介绍两类常用的基因克隆策略定位克隆策略、功能克隆策略及其主要方法，如：家系连锁分析、等位基因共占法、人群相关分析法、抑制性消减杂交、差示反转录 PCR、差异消减显示法、代表性差异分析法、比较基因组杂交等，并作简要的评价。 关键词 基因；定位克隆；消减杂交 学科分类号 Q785 Strategies and methods for cloning pathog
2、enic gene SHEN Hai-ying, ZHOU Yuan-guo. (Center of Molecular Biology, Research Institute of Surgery and Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042) Abstract Isolation and cloning of pathogenic gene is a hot spot in functional genome study, while it is the disease background
3、 which decides the selection of the strategies. Two strategies, mapping strategy and functional cloning strategy, which can clone the objective gene rapidly and accurately were introduced. Some main methods including family-based linkage analysis, allele sharing method, population association analys
4、is, suppression subtractive hybridization (SSH), differential display reverse-transcription PCR (DD-RT-PCR), differential subtraction display (DSD), representational difference analysis (RDA), comparative genome hybridization (CEH) were elucidated briefly. Key words: Gene; Mapping clone; Subtractive
5、 hybridization 基因组全序列测定可望提前完成，而以功能鉴定为中心的功能基因组学应运而生，将人类 510 万个基因定位及克隆是一项庞大而艰巨的任务。自 1911 年 Wilson 将色盲基因定位于 X 染色体起，随着连锁分析方法的发展和体细胞杂交、重组 DNA、分子杂交以及 PCR 技术的发现和应用，陆续出现了几种改进或全新的遗传学基因定位和克隆方法。与此同时，另一类以消减杂交为基本原理的代表性差异分析、基因组错配扫描、比较基因组杂交及 mRNA 差示等方法的出现和应用，使一些多基因遗传病相关致病基因的筛查和定位面临突破。迄今为止，约有 5000 个遗传性状被定位，其中 400 多
6、个为致病基因1。根据不同的背景资料，人类基因克隆可采取的思路有以下四种（见附图）： 目前人类基因克隆的主要策略有三种：一是反向遗传学定位克隆策略，它通过 RFLP、微卫星 DNA 等遗传标记，先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选，并获得 cDNA 及全基因；另一类是从蛋白质功能着手的功能克隆策略，采用以消减杂交为策略的多种分子生物学手段，先通过消减获得特异表达或缺失的基因片段，然后进行染色体定位乃至获得全基因。本文拟就前两种主要策略和各自方法的优缺点作一介绍和分析。此外，尚有介于两者之间的候选克隆策略，包括定位候选克隆和功能候选克隆，前者是在将疾病
7、基因以连锁分析和染色体分析基本定位以后，再在候选区域内选择所有已知基因进行致病突变的筛选。后者是根据致病基因的可能功能，检测 Genbank 中的基因功能区域，将含有接近功能域的基因用于致病的突变检测。 1. 定位克隆（positional cloning）策略 其基本思路是通过连锁分析（linkage analysis）原理进行基因定位。若多态标记与待定基因距离较远，则它们在向子代传递时会发生自由分离，呈“连锁平衡”；反之，则不发生自由分离，而呈现“共分离（co segregation）”现象，即“连锁不平衡”。据此可在染色体上定位与某一 DNA标记相连锁的基因。两基因间连锁程度以遗传距离表
8、示：1 厘摩(cM)=1%重组率，即 1000kb。DNA 标记的选择经历了从致病基因ABO、HLA 多态位点RFLP微卫星 DNA 的发展过程。微卫星 DNA（microsatellite DNA），是一种遍布于真核基因组的短重复序列、长度 210bp 之间、按孟德尔方式遗传、呈高度多态，能进行 PCR 扩增。除 DNA 标记的进展外，基因定位也得益于连锁分析方法和理论的改进，目前主要有：家系连锁分析、等位基因共占法及人群相关性分析等。 1.1 家系连锁分析（family-based linkage analysis）法 是以二代或二代以上的家系材料为基础，观察标记位点与疾病致病基因位点在家
9、系内是否呈共分离，并计算出遗传距离及连锁程度。目前最常用的方法是优势对数计分（Lods）法，Lod 值代表两位点连锁的机率与不呈连锁的机率比的对数值，3 肯定连锁，100kb），不能用于 TDT 分析。 1.4 cDNA 筛选 染色体定位只是定位克隆的第一步。由于 cDNA 筛选、确认的困难，使其成为定位克隆策略的“瓶颈”所在。目前获得基因序列的方法大致有9：对500kb 的关键部位进行直接测序；比较基因组作图和测序；基因结构特征分析，有关的信息可以从 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/xREFdb/中得到；cDNA 捕获，并采用突变检测体系进一步验证疾病相关基因，主要有
10、CpG 岛捕捉层析法、外显子捕捉法、直接筛选 PCR 法等方法。cDNA 筛选往往涉及到能够获得合适的标本（如存在缺失、无义突变等），有时甚至出现已获得该基因的 cDNA 全序列，因未发现在患者中的突变而无法确认的现象。 2. 消减杂交（subtractive hybridization）策略 消减杂交原理是将不同个体或不同细胞来源，即通常所指的样本（tester, T）方和参照（driver, D）方的 DNA 或 mRNA 进行杂交，两者之间的差异，如缺失或特异表达的部分，因不能形成杂交体而被筛选出来10。该类方法有：差示反转录 PCR、代表性差异分析、S1 富集法、抑制性消减杂交、基因组
11、错配扫描、比较基因组杂交及差异消减杂交等。 2.1 消减杂交（subtractive hybridization, SH）法和抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization, SSH）法 消减杂交法包括消减 gDNA 及消减 cDNA 文库。消减 gDNA 文库是将两种来源的 DNA 杂交，以分离较大片段的染色体缺失。Kunkel 等将 DMD（Duchenne muscular dystrophy）基因克隆成功，是该方法第一次在疾病基因克隆中发挥作用。消减 cDNA 文库法是筛选某种特异表达的 cDNA 片段。上述两种消减杂交法缺点在于缺乏有效的富
12、集手段，不能获得较小的 DNA 缺失片段或表达量较低的 mRNA。 SSH 法原理是11：先将 T 方与 D 方 mRNA 逆转录成 cDNA，然后用限制性内切酶将两者切割为小片段。把 T 方均分为二后分别连接不同的接头，与过量的 D 方 cDNA 进行不充分杂交，然后混合两份杂交样品，再与新加入的变性 D 方 cDNA 进行第二次消减杂交，杂交后完全补平末端，加入合适引物接头（接头 1 与接头 2 引物）进行 PCR 扩增获取目的片段。该技术避免了SH 中分离单双链 DNA 的步骤，且因每一 mRNA 逆转录成的 cDNA 可经酶切为一个以上的片段，故检测效率较高，二轮杂交和二轮 PCR 可
13、扩增大量的特异表达片段，能分离出 T 方上调表达的基因，具有假阳性少、重复性强的优点12。其缺点是：所需起始材料较多（mRNA 需数微克）；较多依赖于 PCR 技术中酶切后与接头的连接效率；不能同时进行数个材料或不同处理材料之间的比较。 2.2 差示反转录 PCR（differential display reverse-transcription PCR，DD-RT-PCR）法和差异消减显示（differential subtraction display, DSD）法 DD-RT-PCR 法13是比较不同组织或不同状态下 mRNA 表达的差异，原理为：利用真核细胞 mRNAs 结尾处 po
14、lyA 结构，设计一套（12 条）3端象 T12MN 样引物，在 5端再设计 20 条(10-mer)随机顺序的引物，可使不同长度的基因得到扩增。在测序胶上切下差异片段进行 PCR扩增并进一步分析。该法简便、高效、易行、实验周期短（仅需一周），同时可以比较大批样本，对样品的要求较低，可检测低丰度的 mRNA。不足的是：部分已获的 cDNA 片段不一定是产生某一性状或疾病的原因，而可能是该疾病或性状发生后的表达产物；信噪比过低，可出现非特异扩增，假阳性条带多；工作量大、无法定量研究；扩增的条带往往是 3UTR 区的一段短序列，所含信息量少，常造成筛选困难。 DSD 法14是在 DD-RT-PDR
15、 呈现出差异条带之后，同时回收差异条带与 D 方相应范围的条带，回收的 D 方差异条带用非生物素标记的引物与 dNTPs 进行 PCR 扩增，其产物进行消减杂交，用链亲和素去除共有的产物，剩下的产物由带有 -32PdATP 的 dNTPs 进行扩增，再重复差异显示，回收差异条带并克隆。此技术的最大优势是所获差异条带 Northern 杂交重现性好、假阳性少、敏感性强，可获得长片段，对起始材料要求少，可获得低丰度差异表达基因。缺点是步骤繁琐、工作量大、周期长、更多依赖于 PCR 技术。 2.3 代表性差异分析（representational difference analysis, DRA）法
16、和 S1 核酸酶介导的缺失基因探针富集法 RDA 法包括基因组 DNA（gDNA）代表性差异分析和 cDNA 代表性差异分析15。其原理是：T 方和 D 方 cDNA 在进行差示分析前，采用不同的限制性内切酶酶切，将两者 PCR 扩增后液相杂交，除去共有部分（称为消减富集）。只有 T 方 DNA 中仅有的序列能与自身复性形成 3末端突出的粘性末端，再加入 TaqDNA 多聚酶，那些自身变性的 5端带有接头的双链 DNA 的 3端被补平。并以其为 PCR 引物的结合点，富集 T 方中特有序列（称为动力学富集）。该法优点是：假阳性少，不会产生象 DD-RT-PCR 那样模凌两可的结果，从而降低了随后分析的难度；cDNA RDA 可用于非 polyA 结尾的 mRNA 的检测，且可选择性扩增 T 中的单拷贝序列；在复杂性状相关基因定位中，可应用 RDA 法构建染色体区域连锁图，为连锁分析提供条件，同时也可以将这些片段作为侯选基因筛查的探针。 S1 富集法16的原理近似与 RDA 法，所不同的
