《高效液相-电化学法测定大鼠血浆中单胺类神经递质及其代谢产物》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相-电化学法测定大鼠血浆中单胺类神经递质及其代谢产物（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1高效液相高效液相-电化学法测定大鼠血浆中单胺类神经递质及其代谢产物电化学法测定大鼠血浆中单胺类神经递质及其代谢产物崔翰明，白 鸽，黄世敬，张春光，张秋燕（中国中医科学院广安门医院，北京 100053）摘要摘要 目的目的：建立高效液相色谱-库仑阵列电化学法测定大鼠血浆中的单胺类神经递质及其代谢产物含量的分析方法。方法方法：采用 Agilent 公司的 1200 型高效液相色谱仪和 ESA 公司库仑 2 通道电化学检测器，以 3，4 二羟基苄胺（DHBA）为内标，测定大鼠血浆中的肾上腺素（E） 、去甲肾上腺素（NE） 、多巴胺（DA） 、高香草酸（HVA）和 5-羟色胺（5-HT）的含量。色谱柱
2、：Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6mm150mm, 5m） ，加 EasyGuard 预柱；流动相：含一水合柠檬酸 80mmolL-1，柠檬酸三钠 73.4mmolL-1，1辛烷磺酸钠0.12mmolL-1，乙二胺四乙酸二钠 0.1mmolL-1，18甲醇的混合溶液，pH4.3；流速：1.0mLmin-1；柱温：25；进样量：10L；测定电极电势：-150mv 和 400mv。结果：结果：NE、E、DA、HVA 和 5-HT 的最低检测浓度分别为 2.0，3.0，5.4，5.2，11.1 ngmL-1；平均回收率分别为 99.72、85.33、83.15、120.43、10
3、3.56；日内(n=6)和日间(n=3)精密度 RSD 小于 9.12。结论结论：本方法操作简便，准确，快速，灵敏度高。可用于大鼠血浆中相关单胺类神经递质的检测和研究。关键词关键词 单胺类神经递质；高效液相色谱；库仑阵列电化学检测器；儿茶酚胺Measurement of monoamines neurotransmitter and their metabolites in rat plasma by HPLC with Coularray DetactionCUI Han-ming，BAI Ge，HUANG Shi-jing，ZHANG Chun-guang，ZHANG Qiu-yan(Gu
4、anganmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Science, Beijing 100053, China)Abstract Objective To establish a measurement method on determining the level of monoamines neurotransmitter and their metabolites in rat plasma by HPLC with Coularray Detector-2. Methods The level of NE, E, DA, HVA a
5、nd 5-HT in rat plasma were determined by Agilent 1200 HPLC with ESA Coularray Detector-2. Mobile phase consisted of 80mmolL-1 Citric acid monohydrate, 73.4mmolL-1 Citric acid trisodium salt, 0.12mmolL-1 1-Octanesulfonic acid sodium salt, 0.1mmolL-1 EDTA-Na2 and 18% methanol mixture solution(pH4.3).
6、Flow rate was 1.0 mLmin-1.The Column was Zorbax Eclipse XDB-C18 （4.6mm150mm, 5m）and Easyguard guard column at 25. The voltage of electrode was -150mv and 【收稿日期】2009-07-032【通讯作者】崔翰明，Tel：（010）88001470，13161793870；E-mail：Cui- 【基金项目】国家自然科学基金（编号：30672696）400mv. Results The minimum measurement limit of N
7、E, E, DA, HVA and 5-HT were 2.0, 3.0, 5.4, 5.2 and 11.1 ngmL-1, respectively. The average recoveries were 99.72, 85.33, 83.15, 120.43 and 103.56, respectively. The RSD of intra-day (n=6) and inter-day (n=3) were less than 9.12%. Conclusion The method was easy to operate, rapid, accuracy and high sen
8、sitivity, and could be applied in quantity determination and study of monoamines neurotransmitters and their metabolites in rat plasma. Keywords monoamines neurotransmitter; HPLC; Coularray ECD; Catecholamines动物体内的单胺类神经递质及代谢产物主要有肾上腺素（E） 、去甲肾上腺素（NE） 、多巴胺（DA） 、高香草酸（HVA） 、香草扁桃酸（VMA） 、5-羟色胺（5-HT）和 5-羟吲哚
9、乙酸（5-HIAA）等，其中结构为儿茶酚胺类的有 E、NE、DA、HVA 和 VMA，结构为吲哚胺的有 5-HT、5-HIAA。准确测定血浆中这些物质的浓度变化对于相关疾病的诊断和转归变化有重要意义。目前测定单胺类神经递质的方法通常有 HPLC-ECD 法、荧光法、放免分析法等。由于单胺类神经递质及代谢产物在体内含量很少且易氧化还原，同时血液样本成分复杂，干扰较多，适合于采用具有良好分离能力和测定灵敏度的高效液相色谱-电化学检测法1,2。本文采用 HPLC-ECD 法，建立了同时测定大鼠血浆中 5 种单胺类神经递质及代谢产物的含量测定方法。本方法具有快速简便、灵敏、准确的特点。1 1 材料和方
10、法材料和方法1.1 仪器仪器 美国 Agilent 公司的 1200 型高效液相色谱仪；ESA 公司 2 通道库仑电化学检测器(Model 5300A Coularray Detector-2)，电极：ESA Model 5011A 高灵敏分析电极和 5020保护电极；软件：Agilent 公司 Chem Station B.03.01 Version；CF15D2 型低温高速离心机；MILLIPORE 超纯水器；SY7200DH 超声波发生器； FA2104 电子分析天平等。1.2 试剂试剂 E、NE、DA、HVA、VMA、5-HT、5-HIAA、DHBA、1辛烷磺酸钠、一水合柠檬酸、柠檬酸
11、三钠，乙二胺四乙酸二钠均为 Sigma 产品；甲醇为 Merck 公司产品；高氯酸及其他试剂均为国产 AR 级；实验用水为超纯水。1.3 色谱条件色谱条件 色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18 （4.6mm150mm, 5m） ，预柱：EasyGuard 保护柱（Dikma 公司） ；流动相：含一水合柠檬酸 80mmolL-1，柠檬酸三钠73.4mmolL-1，1辛烷磺酸钠 0.12mmolL-1，乙二胺四乙酸二钠 0.1mmolL-1，含 18甲醇的混合溶液，pH4.3；流速：1.0mLmin-1；柱温：25；进样器温度：4；进样量：10L；测定电极电势：-150mv 和 4
12、00mv。31.4 标准液的配制标准液的配制 1.4.1 标品母液的配制：精密称取 VMA、NE 、E、DHBA、DA、HVA、5-HT 的标准品 各约 1mg，分别溶于 1mL 蒸馏水中，得浓度约为 1000gmL-1的母液。-80避光保存。母液浓度分别为：VMA：1.20mgmL-1，DHBA：1.24 mgmL-1，E：1.13 mgmL-1，NE：1.09 mgmL-1，5-HT：1.26 mgmL-1，DA：1.04 mgmL-1，HVA：1.34 mgmL-1。1.4.2 标品储备液和混合标品储备液的配制 取标品母液各 10L，分别加入 990L 蒸馏水，即得浓度约为 10gmL-
13、1的标品储备液。取标品母液各 10L 充分混合，加入 930L 蒸馏水混匀，即得浓度约为 10gmL-1的混合标品储备液。-20避光保存。两周内使用。1.4.3 标准品溶液的配制 精密量取适量标品储备液，分别用流动相稀释，配制成浓度分别约为 1，5，10，50，100，500 ngmL-1的标准品溶液，置 4避光保存。1.51.5 血浆样品的前处理血浆样品的前处理： 体重 200300g 雄性 SD 大鼠，采用玻璃毛细管自眼眶采血或自股动脉抽血，置于肝素抗凝的 EP 管中，迅速 4条件下 12000g 低温离心 15min，吸取血浆-80oC 冻存备用。取冻存血浆，室温解冻，精密吸取 100L
14、，加 6.2ngL -1的 DHBA内标液 2L ,再加 0.1M 高氯酸 100L，混匀，再加浓高氯酸 8L，4条件下 12000g 低温离心 10min，上清液直接进样。2 2 实验结果实验结果 2.12.1 色谱行为色谱行为 在上述色谱条件下,标品和血浆中的各峰型对称，无内源性杂质干扰峰，各峰分离效果较好。整个色谱可在 12min 完成，VMA、NE、E、DHBA、DA、HVA、5-HT 保留时间分别见图 1 和图 2。图 1. 混合标准品色谱图(1-7 分别为 VMA、NE、E、DHBA、DA、HVA、5-HT)4图 2. 大鼠血浆样品中 NE、E、DHBA、DA、HVA、5-HT 色
15、谱图2.2 标准曲线标准曲线 由于血浆样本中均存在以上内源性生物胺，故无空白标本。本实验用NE、E、DHBA、DA、HVA、5-HT 标准液稀释成 500，100，50，10，5，1 ngmL-1的 6个不同浓度，依次测定后以对照品峰面积比内标峰面积，对浓度进行线性回归并计算相关系数 r。各回归方程分别为：NE：Y=790.54X+1.5969，r=0.9997；E：Y=712.89X+0.8929，r=0.9999；DA：Y=1078.6X+1.7465，r=0.9999；HVA：Y=1005.1X+0.8325，r=0.9999；5-HT：Y=586.46X+1.1751，r=0.9999
16、。结果表明，NE、E、DA、HVA、5-HT 在 1500 ngmL-1的浓度范围内线性良好。2.3 血浆样品加样回收率血浆样品加样回收率 取同 1 只大鼠血浆 7 份，其中 6 份血浆分别加入约 50ngmL-1的对照品标准液，分别按 1.5 血浆样品的前处理方法处理，按照 1.3 色谱条件测定，将加入标准液后测得的峰面积与内标峰面积的比值减去空白血浆样品测得的峰面积与内标的比值，根据标准曲线分别计算血浆中加入的 NE、E、DA、HVA 和 5-HT 的量，与实际加入量比较，计算各物质的回收率和 RSD（%） ，结果见表 1。表 1 加样回收试验结果（n=6S）x被测物样品含量(ngmL-1)测得量（ngmL-1）加样回收率（%）RSD（%）NEEDAHVA5-HT54.556.552676354.35
