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1、页 码： 1/4文件编码：SOP- 81021 广西北斗星动物保健品有限公司广西北斗星动物保健品有限公司 操操 作作 标标 准准 版 本 号： 01 题 目：钴钴 6060 辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用 SOPSOP制定人：审核人：批准人：颁发部门：质量部制定日期：审核日期：批准日期：生效日期：分发部门：质量部文件编写/修订历史：本文件为首次制定1 目的：目的：建立钴 60 辐照灭菌生物指标菌生孢梭菌 CMCC（B）64 941 的使用规程，保证正确使用，对钴 60 辐照灭菌效果进行验证。2 适用范围：适用范围：适用于用钴 60 辐照灭菌生物指标菌生孢梭
2、菌 CMCC（B）64 941 对钴 60 辐照灭菌效果进行的监测。3 职责：职责：钴 60 辐照灭菌操作人员、QA 人员、QC 微生物检验员对本标准的实施负责。4 方法：方法：4.1 生孢梭菌作为供试品无菌检查的厌氧对照菌。4.2 培养基的制备4.2.1 营养肉汤培养基胨 10.0g，氯化钠 5.0g，牛肉浸出粉 3.0g，水 1000mL。取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，调节 pH 值使灭菌后为 7.20.2,分装，灭菌。4.2.2 营养琼脂培养基按上述 4.2.1 营养肉汤培养基的处方及制法，加入 14.0g 琼脂，调节 pH 使灭菌后为 7.20.2,分装，
3、灭菌。4.2.3 硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌氧菌）酪胨（胰酶水解） 15.0g，氯化钠 2.5g，葡萄糖 5.0g，新配制的 0.1%刃天青溶液 1.0mL,硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸 0.3mL） 0.5g，L-胱氨酸 0.5g，琼脂 0.75g，酵母浸出粉 5.0g,水 1000mL。页 码： 2/4文件编码：SOP- 81021 广西北斗星动物保健品有限公司广西北斗星动物保健品有限公司 操操 作作 标标 准准 版 本 号： 01 题 目：钴钴 6060 辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用 SOPSOP除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温
4、溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节 pH 值使灭菌后为 7.10.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的 1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的 1/5，否则，须经 100水浴加热至粉红色消失（不超过 20 分钟） ，迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。硫乙醇酸盐流体培养基置 3035培养。4.2.3 改良马丁培养基（用于培养真菌）胨 5.0g，磷酸氢二钾 1.0g，酵母浸出粉身碎骨 2.0g，硫酸镁 0.5g，葡萄糖 20.0g，水 1000mL。除葡萄糖
5、外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 值约为 6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节节 pH 值使灭菌后为 6.40.2，分装，灭菌。改良马丁培养基置 2328培养。4.3 菌液的制备接种生孢梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养 1825 小时，培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1mL 含菌数小于 100cfu（菌落形成单位）的菌混悬液。4.4 稀释液、冲洗液及其制备方法4.4.1 0.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨 1.0g,加水 1000mL,微温溶解，滤清，调节 pH 值至 7.10.2,分装，灭菌。4.4.2 pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾
6、 3.56g、磷酸氢二钠 7.23g、氯化钠 4.30g、蛋白胨 1.0g、加水1000mL,微温溶解，滤清，分装，灭菌。4.6 供试品的无菌检查页 码： 3/4文件编码：SOP- 81021 广西北斗星动物保健品有限公司广西北斗星动物保健品有限公司 操操 作作 标标 准准 版 本 号： 01 题 目：钴钴 6060 辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用 SOPSOP取本品 4 瓶，每瓶取 10mL,混匀，取 25mL 转移至 250ml 含 1%聚山梨酯-80 的 0.1%无菌蛋白胨溶液中，充分振摇使其分散，加入 -内酰胺酶溶液（每 1 mg 盐酸头孢噻呋加头
7、孢菌素酶不得少于 1000 单位），充分振摇，置 37水浴中加热 1 小时后，取出，按如下方法进行检查。取上述处理过的样品 10mL 接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的 10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于 15mL, 改良马丁培养基每管装量不少于 10mL。每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。4.5 培养及观察上述含培养基的容器按规定的温度培养 14 日，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后，或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养 14 日后，不能从外观上判断有
8、无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养 2 日，真菌培养 3 日，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。5 结果判断结果判断若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判断试验结果无效：无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；阴性对照管有菌生长
9、；供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生页 码： 4/4文件编码：SOP- 81021 广西北斗星动物保健品有限公司广西北斗星动物保健品有限公司 操操 作作 标标 准准 版 本 号： 01 题 目：钴钴 6060 辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用 SOPSOP长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。6 6注意事项：注意事项：6.1 试验所用的设备及环境的微生物监控结果应符合无菌检查法的要求；6.2 供试品辐照灭菌的最终辐照剂量应经不同辐照剂量的筛选试验后确定。经筛选试验，选择符合无菌要求的最小辐照剂量做为灭菌剂量。
