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1、红壤样品红壤样品 S1、S2 微生物总微生物总 RNA.的提取方法及比较的提取方法及比较目的及原理：RNA 分子的分离提取是分子生物学研究中的基本内容，是进行基因表达分析的基础。从生物体中提取高质童的 RNA 是进行基因克隆和基因表达分析的基础。从土壤微生物中提取纯度高和完整性好的 RNA是研究微生物表达组学的重要前提。RT-PCR、cDNA 合成、Northern 印迹杂交、cDNA 文库构建等分子生物学研究均需要有高质量的 RNA。环境微生物总 RNA 的提取由于环境样品中 RNA 酶含量丰富，RNA 易被降解，给提取分离带来了许多困难。本实验通过对 4 种方法提取的水稻土微生物 RNA
2、产量和质量进行了比较，筛选适合于典型水稻土的 RNA 提取方法。实验方案：方法 1 用液氮研磨法提取的 RNA 提取量最高，但需要纯化后才能满足RT-PCR 等后续分子生物学要求；方法 2 用玻璃珠破碎法提取的 RNA 提取量稍低，但 RNA 纯度较高，可以直接用于 RT-PCR 等后续实验；方法 3 用试剂盒提取的 RNA 纯度高，但提取量最低，成本高，且对土壤样品有选择性；方法 4 未能提出供试土壤的微生物 RNA.。具体过程：1.总 RNA 的提取：1.1 方法 1 液氮研磨法参考 Hurt 等方法，并作适当修改.具体步骤如下：称取 2 g 干土和 2g 烘干的无菌沙(粒径约 0.25
3、mm)放于预冷研钵中.倒入液氮，研磨约 5 min，研磨过程中不断添加液氮，防止其完全挥发.将研磨样品放入 50 mL 离心管中，加入 15 mL 提取液(100 mmolL1 磷酸钠缓冲液 pH 7.0，100 mmolL1 Tris-HCl pH 7.0，100 mmolL1EDTA pH 8.0，1.5 molL1 NaCl，1%CTAB pH 8.0，2%SDS pH 7.2)，65水浴30min，每隔 10 min 摇动一次.2 000 r/min，4，离心 10 min.将上清转移至 50 mL 新离心管，加入 20 mL 预冷的氯仿/异戊醇(241，体积比).原管中剩余上清与土样
4、混匀后，65水浴 5 min，重复、的步骤.上清与氯仿/异戊醇轻柔混匀，2 000r/min，4，离心 20 min.水相移至50 mL 新离心管中，加入 0.6 倍体积的异丙醇室温沉淀 30 min.10 800 r/min，室温离心 20 min.沉淀在无菌台干燥，100L DEPC 处理过的水溶解。1.2 方法 2 玻璃珠破碎法参考 Griffiths 等方法，稍加修改.称取 0.5 g 干土和0.5 g 玻璃珠(直径 0.50 mm)，放入 2 mL 离心管中，加入 0.5 mLCTAB 提取液(5%CTAB pH 8.0，0.7 molL1NaCl，0.12 molL1 磷酸钠缓冲液
5、 pH 8.0)和 0.5mL 苯酚/氯仿/异戊醇.放于转速 1 500 r/min 的涡旋仪上，10 min.10 800 r/min，4，离心 10 min，上清移至等体积氯仿/异戊醇(241，体积比)中.10 800 r/min，4，离心 10 min(抽提两次).上清加入 2 倍体积 30%PEG8000-1.6 molL1NaCl，室温沉淀 2 h.12 000 r/min，4，离心 15 min.70%预冷乙醇洗涤沉淀，无菌台干燥，沉淀用30LDEPC 处理过的水溶解。1.3 方法 3 使用试剂盒(Omega)操作按照说明进行。1.4 方法 4 参考 Ogram 等5方法稍加修改:
6、称取 4 g 干土，加入 8 mL 提取液(0.2 mol L1 磷酸钠缓冲液 pH 8.0，0.1 molL1EDTA pH 8.0)和1.5 mL 10%SDS，混匀.沸水浴，5 min.80，30 min.65水浴，20 min，每隔 10 min 摇一次.8 000 r/min，10，15 min.取上清，加入11.2 mLGIPS(4 molL1 异硫氰酸胍，0.5%N-十二烷基肌氨酸钠，0.025 molL1 醋酸钠 pH 7.0)，11.2 mL 苯酚，6.4 mL 氯仿/异戊醇(241，体积比)，轻柔混匀.土样再加入 5 mL 提取液，混匀，65水浴 10min，重复的步骤.4
7、 000 r/min，4，10min.上清加入 0.6 倍体积异丙醇沉淀 2 h.7 000 r/min，4，20 min，70%预冷乙醇洗涤沉淀，无菌台干燥，沉淀用 30L DEPC 处理过的水溶解。2. 用方法 1 和方法 2 提取样品微生物总 RNA.3. 去除 RNA 中的 DNA4. RNA 质量检测及提取率检测5. RT-PCR结果分析：1. RNA 完整性检测：方法 1 提取的土壤样品的 RNA 完整性好，基本没有降解。方法 2 采用玻璃珠振荡破碎细胞，从电泳图上 RNA 完整性较好。方法 3 使用 Omega 公司的土壤 RNA 提取试剂盒，得到土样 S1 的 RNA 与方法
8、2 的完整性相似，有部分降解发生，此试剂盒没有提取出土样的RNA，电泳检测不到。方法 4 提取的微生物 RNA 几乎全部降解或者未提取出，电泳检测不到 RNA的条带(图 2)，无法进行后续的分子生物学操作。2不同提取方法的土壤样品 RNA 的产量和纯度分析方法 1 对 2 种土壤的提取量最高，分别是方法 2、方法 3 的 4 倍和 6 倍，但是提取土壤的 RNA 的 D260/D230 值较低，说明腐殖酸等物质干扰严重；方法 2 较方法 1 的提取量均低，但仍显著高于方法 3，并且 RNA 纯度较高，D260/D280 和 D260/D230 都高于方法 1，与试剂盒(方法 3)提取得到的纯度
9、基本接近；方法 3 得到的土壤 S1 的 RNA 纯度高，但提取量最低且每次提取的差异很大(sd=1.89)。结论：本研究的 4 种方法中，方法 4 不适于提取典型水稻土微生物 RNA，方法 3 成本高且适用范围有局限性，方法 1 和方法 2 成本低且 RNA 提取效果好，是较适合提取典型水稻土微生物 RNA 的方法.为进一步研究这 2 种方法适用的广泛性，方法 1 和方法 2 被进一步测试典型水稻土.由实验结果可知，这 2 种方法均可从上述土壤中提取出较完整的微生物 RNA。参考文献：1曹建斌. RNA 的提取及 3 种 RNA 提取试剂盒的比较M. 科技情报开发与经济,2008,18(10):206-2072付畅,王豫颖,代红杰. 大豆不同器官中的 RNA 的提取分析J. 大豆科学,2004,23(4):281-2843 郑燕,陈哲,侯海军等. 典型水稻土微生物 RNA 的提取方法比较平J. 环境科学,2010,31(4):1066-10714 段西飞,王静华,崔江慧等. 高粱总 RNA 的提取J. 华北农学报, 2008,23: 153-1555赵百慧,郑彩霞,徐利利等. 油松成熟胚总 RNA 的提取方法J. 安徽农业科学, 2010,38(6):2812-2814
